麂属动物小麂线粒体DNA文库的建立和序列分析

通过建立麂属动物小麂线粒体DNA文库，鸟枪法测序，我们获得了小麂线粒体基因组全序列的初步信息，这也是国内有关哺乳动物线粒体基因组全序列的首次报道，与其他哺乳动物线粒体基因组全库列的比较研究发现：全长为16354bp的小麂线粒体基因组同样编码13种蛋白、2种rRNA和22种tRNA，除了用于调控线粒体DNA复制和转录的D-Loop区以外，小麂线粒体基因组各基因长度，位置与其他哺乳动物相似，其编码蛋白质区域的rRNA基因与基因他哺乳动物具有很高的同源性，D－Loop区长度和序列的差异是导致各种哺乳动物线粒体差异的主要原因。     

大黄鱼基因组DNA的不同提取方法及RAPD扩增比较

采用三种方法提取大黄鱼肌肉基因组DNA,并以所提取的DNA为模板进行RAPD分析比较。结果表明,与传统方法、高盐抽提法相比,星普法具有快速简便、所需样品量少,所提取的DNA质量高等特点。三种方法所得的DNA分子量大小都在20kb以上,且RAPD扩增条带基本一致。     

PRV广东株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据伪狂犬病病毒（PRV）Rice株gE基因的序列设计并合成了1对引物,以我国PRV地方毒株广东株的基因组DNA为模板,通过PCR方法获得了一大小约1.6kb的DNA片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序,序列测定结果显示,该片段长1665bp,编码555个氨基酸,与PRV Rice株gE基因的核苷酸序列同源性为97.7%,氨基酸序列同源性为95.9%。     

大黄鱼基因组DNA的不同提取方法及RAPD扩增比较

采用三种方法提取大黄鱼肌肉基因组DNA,并以所提取的DNA为模板进行RAPD分析比较.结果表明,与传统方法、高盐抽提法相比,星普法具有快速简便、所需样品量少,所提取的DNA质量高等特点.三种方法所得的DNA分子量大小都在20kb以上,且RAPD扩增条带基本一致.     

活性污泥基因组DNA快速提取新方法及其指纹分析

建立了从活性污泥中快速提取基因组DNA的新方法,过程包括粗提与精制两个步骤,简化了繁琐的提取程序,提高了提取效率．用该方法提取的基因组DNA做模板,进行扩增核糖体限制性酶切片断分析（ARDRA）及核糖体基因间区序列分析（RISA）,均获得了理想的多态性指纹图谱;采用两对特异性引物（鞘氨醇单胞菌属和氨加氧酶基因）对所提污泥基因组DNA进行扩增,均获得了正确的PCR产物．该方法提取的污泥基因组DNA不但适用于研究污泥系统中菌群多样性分析,而且还可以对特定基因进行跟踪监测。     

硅藻DNA片段在表达质粒pMZR中再克隆的研究

用部分酶切法切开表达质粒 pMZR 中一个 HindⅢ位点后,插入了一个带 HindⅢ粘性末端的1kb 硅藻 DNA 片段重组 DNA 分子转化 E.coli LE392,对转化子中的重组 DNA 分子用酶切分析后,鉴定了1kb DNA 片段插入 pMZR 的位置。     

DNA序列在植物系统进化研究中的应用

DNA序列分析已广泛应用于植物系统与进化学研究，根据不同的研究对象和问题选择相对应的DNA序列来进行研究显得十分重要。目前在植物系统与进化学中主要一些DNA的应用，主要是讨论叶绿体基因组（rbcL等）和核基因组（18S，ITS）中的特定DNA序列区段。研究表明，18S,rbcL等编码基因一般适用于较高分类阶元甚至整个种子植物谱系间的系统发育的探讨，而ITS极cpDNA的非编码区序列等因其较快的进化速率多用于较低分类阶元的系统关系研究。     

甲醛溶液保存的中华哲水蚤基因组DNA提取和PCR扩增

提取了保存于5％甲醛溶液中的单只中华哲水蚤基因组DNA．经凝胶电泳后虽无清晰条带．但PCR扩增后可得线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因(mtCOI)片段．测序分析，该片段长度为710bp。与GenBank中的序列(索引号AF332769)比对后确定为中华哲水蚤mtCOI序列的一部分．利用本实验方法所提取的基因组DNA可适用于系统发生、种群遗传结构等领域的分子水平研究．为保存在甲醛溶液中的小型海洋浮游动物的基因信息利用提供实用技术。     

黑木相思基因组DNA的快速提取

用SDS高盐介质法和1.5×CTAB法提取黑木相思幼叶及叶状柄基因组DNA,将其与2×CTAB法、3×CTAB法、改进的CTAB法进行比较,并用紫外光谱吸收、凝胶电泳、限制性内切酶消化、RAPD(Radomly Amplified Polymorphic DNA)和ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)等方法进行鉴定.结果表明,叶状柄多糖的质量分数较幼叶少,更易于基因组DNA的提取;SDS高盐介质法与1.5×CTAB法提取叶状柄的基因组DNA得率为180.0～697.5 μg·g-1,分子质量为48 kb,D(260)/D(280)=1.750～1.955,无需经Rnase 处理,可直接用于限制性酶切和RAPD及ISSR分析;1.5×CTAB法所提的基因组DNA的纯度优于SDS高盐介质法.综合考虑认为,1.5×CTAB法可作为黑木相思基因组DNA快速提取的简便方法.     

内蒙古荒漠草原土壤微生物DNA提取方法的研究

利用三种提取方法从内蒙古荒漠草原土壤样品中提取了土壤微生物DNA,得到的DNA片段长度在23 kb以上,提取效果较好无降解.采用试剂盒直接纯化、凝胶回收试剂盒纯化、玻璃珠DNA回收试剂盒SK1111 DNA纯化这三种方法对粗提液进行纯化,结果显示:凝胶回收试剂盒纯化后DNA纯度最高,试剂盒直接纯化可得到较纯的DNA,而玻璃珠DNA回收试剂盒SK1111 DNA纯化的效果不佳,不宜进行后续的PCR扩增.以纯化的土壤微生物DNA为模板扩增了细菌16SrDNA,扩增产物分子量为1.5kb左右.通过比较研究提出了一种适合于从荒漠草原土壤中进行微生物DNA提取、纯化及PCR扩增的有效方法.     

产气荚膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析

利用PCR技术，从C型产气荚膜梭茵中国标准株C59-44基因组DNA中扩增出了约0．7kb的基因，并将其克隆到pGEM-T栽体上，经酶切鉴定及核苷酸序列分析表明，该基因片段的核苷酸序列与国外报道的β2毒素基因序列一致．     

Molecular cloning and expression of Pfu DNA polymerase gene and its application in long-distance PCR

A 2.3 kb DNA fragment containing Pfu DNA polA gene was amplified by PCR from total DNA of Pyrococcus furiosus and cloned into a pGEM-T vector. The recombinant clone pT-pfu was digested with Nco I and Xho I and the fragment was inserted into an expression vector pET3d-X. The Pfu polA gene was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The gene product (Pfu) was purified with heat denaturation, polyethylenemine (PEI) precipitation and Bio-rex 70 ion-exchange chromatography. The recombinant Pfu was verified by protein N-terminal sequencing. With the recombinant Pfu, large λ DNA fragments were successfully amplified in long-distance PCR.     

小鼠Bpi条件基因打靶载体的构建和鉴定

目的构建小鼠Bpi条件基因打靶载体,为建立Bpi条件基因打靶小鼠模型和深入研究Bpi基因功能奠定基础。方法采用Cre/LoxP系统,选择小鼠Bpi基因第2、3外显子作为条件性敲除的目的片段,并在其两侧插入LoxP位点;运用LA-PCR技术,以129品系小鼠ES细胞基因组DNA为模板分步扩增包括Bpi第2、3外显子(中间同源臂)和上游同源臂在内的3.1 kb基因片段以及下游同源臂4.9 kb基因片段;构建pBSKⅡ-5SLoxP和ploxPFRTNeo-3L重组质粒,将前者酶切产物(3.1 kb)与酶切后的ploxPFRTNeo-3L质粒相连获得Bpi条件基因打靶载体。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的pBSKⅡ-5SLoxP、ploxPFRTNeo-3L重组质粒和Bpi条件基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Bpi条件基因打靶载体。     

RecA介导的特异性DNA片段捕获

外显子捕获联合高通量测序技术在检测新的致病基因,特别是罕见的基因变异时,表现出很高的检测效率.但在具体使用过程中,探针易出现非特异性杂交,设计探针时需考虑Tm值均一性、所需初始样品量较大等问题.RecA是原核生物同源重组的中心分子,参与DNA损伤的重组修复.通过在体外模拟RecA蛋白在原核生物体内重组寻找同源序列的途径,用以捕获目标DNA分子,以期提高外显子捕获过程中的探针杂交效率和特异性.根据RecA在体内同源重组中的作用模式,先将基因组染色质片段化,再纯化DNA,设计生物素标记的特异性探针,在RecA蛋白的介导下以捕获基因组中的目的同源片段.结果显示:设计的和目标片段互补的探针高效而特异地捕获了目标DNA片段,ATP和水能够破坏RecA介导形成的三链复合体的稳定性,可以作为很好的杂交后洗脱试剂,而且水直接作为洗脱试剂可以提高洗脱目的 DNA片段的效率和纯度.     

几种基于基因组DNA的真菌分类技术研究进展

基于基因组DNA的真菌分类技术发展迅速。综述了DNA分子杂交技术,真菌线粒体DNA限制性片段长度多态性(m t RFLP)分析,随机扩增多态性DNA(RAPD)分析,rDNA序列分析,扩增片断长度多态性(amp lifiedfragm ent length polymorph ism,AFLP)在真菌分类和系统发育中的应用。     

用加端PCR技术改造h－IGF－1cDNA

用ＤＮＡ合成仪合成了分别带有ＰｓｔＩ位点和ＳａｌＩ位点及终止密码子的２个用于扩增ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ的ＰＣＲ引物．利用合成的引物，７００ｂｐ长的ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ模板和Ｔａｑ聚合酶进行ＰＣＲ扩增．扩增产物经电泳鉴定后克隆进Ｍ１３ｍｐ１８载体，进行核苷酸序列分析．结果显示：ＰＣＲ产物含已发表的ｈＩＧＦ－１成熟蛋白的编码序列和５＇端的ＰＳｔＩ位点及３＇端的ＳａｉＩ位点及终止密码ＴＡＧ．用加端ＰＣＲ技术成功地扩增和改造了ｈＩＧＦ－１的编码序列．     

基于PCR-RFLP的西洋参和人参指纹特征鉴定

目的建立西洋参与人参限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)的鉴定方法.方法采用改良的CTAB法从西洋参和人参中提取基因组DNA.应用生物信息学软件设计西洋参与人参核糖体DNA ITS序列的特异性引物,利用PCR技术对指定序列进行扩增,并通过RFLP方法酶切后进行指纹图谱的鉴别比较.结果提取西洋参与人参基因组DNA19 kb,并扩增核糖体122 bp大小的基因片段,经酶切后西洋参为80 bp和42 bp长度的两条片段,而人参仍然为122 bp长度的单一片段.结论西洋参与人参DNA具有特异性酶切位点,可作为西洋参与人参鉴定的有效方法,该方法简便快速,结果可靠.     

苔藓植物DNA不同提取方法的比较分析

以苔藓植物为材料,比较快速提取法、SDS法和改良CTAB法(自行设计)提取苔藓植物总DNA的效果.结果表明:改良CTAB法提取的基因组DNA质量最好(A260/A280为1.83～1.86;A260/A230为2.05～2.50),快速提取法次之(A260/A280为1.64～1.73;A260/A230为1.68～1.77),SDS法较差(A260/A280为1.51～1.61;A260/A230为1.56～1.76).改良CTAB法提取的苔藓植物的DNA适合于作为PCR的模板,并成功地进行了RAPD扩增.     

Isolation and characterization of a <Emphasis Type="Italic">Sinorhizobium fredii</Emphasis> mutant that cannot utilize proline as the sole carbon and nitrogen source

Sinorhizobium fredii strain HN01 can use proline as the sole carbon and nitrogen source. A mutant strain GXHN100 unable to catabolize proline was screened from 6000 Tn5gusA5 random insertional mutants of S.fredii strain HN01. Sequencing analysis showed that an open reading frame, named pmrA (proline metabolic relative), was inserted by the Tn5gusA5. A positive clone, namedp GXHN100 which containing 3.3kb foreign DNA fragment of S.fredii strain HN01, was isolated from a partial gene library of S.fredii HN01 by colony in situ hybridization. Sequence analysis showed that pGXHN100 contained the entire pmrA gene. The 3.3kb DNA fragment of pGXHN100 was cloned into a broad-host-range cosmid vector pLAFR3 to form plasmid pGXHN200 which was subsequently introduced into GXHN100 to form a complemented strain GXHN200. Plant test showed that GXHN100 was effective and no obvious changes in nitrogenase activity comparing with parental strain. But GXHN100 nodulated 2 days later on soybean and its nodulation efficiency and competitiveness were decreased.The complemented strain GXHN200 restored the nodulation efficiency and competitiveness of GXHN100 to the wild type.