东北七鳃鳗Lm-PHB2的生物信息学分析及多克隆抗体制备

在首次获得七鳃鳗Lm-PHB2的全长cDNA序列的基础上,对预测得到的LmPHB2氨基酸序列进行了生物信息学和进化分析;经原核表达并大量提纯获得重组蛋白rLm-PHB2,在此基础上,优化兔抗七鳃鳗抗体的免疫制备流程.结果表明:七鳃鳗LmPHB2蛋白的理论分子质量约为33.25ku,理论等电点为9.85,为亲水性蛋白;信号肽预测结果表明其ORF区中无信号肽.该蛋白有1个位点可能发生N型糖基化,不存在棕榈酰化位点;跨膜区预测表明Lm-PHB2仅在内膜区域存在跨膜结构.系统发育树分析表明Lm-PHB2的进化地位在头索动物与脊椎动物之间,与物种进化规律基本一致.制备了效价≥64万且与重组蛋白rLm-PHB2和天然Lm-PHB2蛋白均有很强的特异性结合能力的多克隆抗体.Western Blot表明,Lm-PHB2蛋白在七鳃鳗的心、肾、肝和肠中均有表达,其中,在心脏组织中表达量最高.本实验为PHB2基因的进化研究提供了理论依据,并为七鳃鳗Lm-PHB2蛋白功能研究奠定了基础.     

七鳃鳗棕榈酰蛋白硫酯酶1的基因克隆、系统进化及组织特异性表达分析

棕榈酰蛋白硫酯酶1(palmitoyl protein thioesterase 1,PPT1)能够催化棕榈酰蛋白的去棕榈酰化修饰,通过调节蛋白的棕榈酰化修饰参与多种细胞生物学进程.从日本七鳃鳗(Lampetra japonica)白细胞cDNA文库的表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)中获取PPT1基因片段,经RT-PCR扩增获得七鳃鳗PPT1蛋白的全序列cDNA.基因全长为972bp,编码323个氨基酸组成的蛋白质,理论分子量为36.6kDa,等电点为5.91,并含有1个信号肽.通过同源序列比对分析结果显示,日本七鳃鳗PPT1与其他物种PPT具有很高的同源性.利用实时荧光定量PCR法检测到PPT1基因在七鳃鳗的各组织中广泛表达,其中在白细胞、心脏、肠、鳃中表达量较高,在肝脏中表达量最低.本研究为探讨七鳃鳗PPT1功能研究奠定了理论基础.     

七鳃鳗组织蛋白酶D的原核表达及功能初探

组织蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)是一类存在于溶酶体内的天冬氨酸蛋白内切酶,在蛋白质的水解过程中发挥重要作用.七鳃鳗是低等无颌类脊椎动物,通常依靠吸食宿主鱼类的血肉为生.近年研究发现七鳃鳗(Lampetra japonica)的口腔腺中含有组织蛋白酶D基因(Lamprey-cathepsin D,L-CTSD).前期实时定量PCR结果推测L-CTSD可能参与了七鳃鳗体内的消化过程.为了深入研究L-CTSD的生物学功能,实验构建了L-CTSD(Leu21-Val396)的原核表达载体p ColdⅠ-L-CTSD,并将其转化至Rosseta blue表达菌中后采用IPTG进行诱导表达.研究发现L-CTSD以包涵体形式表达,通过变性和复性最终获得了可溶性的重组七鳃鳗组织蛋白酶D(recombinat lamprey-cathepsin D,r L-CTSD,43 k Da).功能实验结果表明:r L-CTSD能够在酸性条件下降解血液中的主要蛋白质成分,如血红蛋白、纤维蛋白原和血清白蛋白等,提示L-CTSD参与了七鳃鳗的消化过程.为深入研究L-CTSD的生物学功能,阐明其在七鳃鳗口腔腺中的作用机制奠定了基础.     

七鳃鳗口腔腺重组蛋白rLj-RGD3对人肝癌HepG2细胞活性的影响

七鳃鳗口腔腺含有RGD功能基因,为了确认其表达蛋白在抑制肿瘤方面的功能,在前期获得带有组氨酸标签的分子量为14．5 kD 的基因重组蛋白 rLj‐RGD3基础上,研究了不同浓度rLj‐RGD3对HepG2细胞的增殖、凋亡、黏附、迁移、侵润的影响．结果显示：rLj‐RGD3能显著抑制HepG2细胞的增殖,IC50为3．8μmol／L ,诱导HepG2细胞发生凋亡,有效抑制 HepG2细胞黏附玻蛋白（VN）,抑制 HepG2细胞的迁移,且抑制率达58％,明显抑制以 bFGF 为趋化剂的 HepG2细胞穿透 Matrigel 的侵润行为．以上研究表明,rLj‐RGD3具有典型的RGD毒素蛋白抑制肿瘤细胞的功能,能够应用于抗肿瘤基因工程药物开发,具有重要的应用意义．     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

厚壳贻贝足腺cDNA文库的构建及部分EST序列分析

为获得厚壳贻贝足腺组织的EST序列标签以及可能的功能基因序列,以pCMVsport6质粒为载体构建了高质量的厚壳贻贝足腺组织cDNA文库,文库滴度为1.31×107pfu/mL,重组率为98%,平均插入片段为1.3kb.通过对文库部分克隆的序列测定,获得了11个新基因和17个功能基因,其中包括部分与厚壳贻贝足丝相关的基因.厚壳贻足腺组织cD-NA文库的成功构建为将来筛选与厚壳贻贝足丝蛋白相关的新基因,系统研究其黏附机制奠定了基础.     

毛竹硅转运基因PhLsi1的ORF克隆及生物信息学分析

以水稻硅的内转运蛋白基因Lsi1的cDNA序列为信息探针,对毛竹的核酸数据库进行同源性搜索,获得全长为797bp的毛竹硅内转运蛋白基因的cDNA序列(Genbank登陆号:FP095571).与水稻Lsi1的cDNA序列相比,毛竹中该基因cDNA序列第721位处发生终止突变,导致毛竹Lsi1丢失了86个氨基酸残基.采用RTPCR方法对其进行克隆,序列分析表明,PhLsi1基因在编码时确实存在提前终止现象,共编码212个氨基酸,与水稻、玉米和大麦中已克隆的硅内转运蛋白(silicon influx transporter,含有6个跨膜螺旋区和2个NIP保守基序)的序列相似性分别高达99.3%,91.9%,91.9%,但只具有5个跨膜螺旋区和1个NIP保守基序.     

斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE方法获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein,TBT-bp)肝脏基因的cDNA全长序列.TBT-bp基因cDNA序列全长836 bp,含696 bp的开放阅读框,编码231个氨基酸.虽然编码蛋白序列与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和底鳉(Fundulus heteroclitus)TBT-bp2序列同源性不高(分别为52%、20%),但是保守的信号肽序列结构与二级结构分析提示它们属于同一蛋白家族.系统树分析表明,此次克隆得到的斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因cDNA序列属于2型三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein type2,TBT-bp2).斜带石斑鱼TBT-bp基因cDNA全序列的获得为海水养殖鱼类中三丁基锡的去毒代谢相关分子机理研究奠定了基础,对今后进一步进行种苗育苗的研发,并以此为依据提高其人工育苗及仔鱼成活率有重要意义.     

家猪BMP-2、BMP-3基因克隆及其组织表达探究

本研究以长白猪(Landrace)肺cDNA为模板,扩增获得猪骨形态发生蛋白BMP-2和BMP-3基因的cDNA全长.BMP-2基因cDNA全长为1742bp,编码395个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-2基因的氨基酸序列一致性分别94.18%,95.4%,95.2%,90.3%,90.60%;BMP-3基因cDNA全长为1639bp,编码475个氨基酸的前体蛋白,猪与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-3氨基酸序列的一致性分别是84.7%、87.7%、82.3%、80.4%、79.5%.采用RT-PCR方法,对BMP-2、3基因在家猪主要组织的表达进行探究.结果显示:BMP-2在所有组织中均有表达;而BMP-3在脑、肺、小肠中表达量较高,其他组织中表达量弱.     

富含半胱氨酸分泌蛋白的结构及其离子通道方面作用的研究进展

富含半胱氨酸分泌蛋白（Cystein—rich secretory protein，简称CRISP），在进化上非常保守，大部分成员功能尚不明了．研究发现，CRISP除广泛存在于哺乳动物、一些爬行动物和软体动物体内，近来我们还在日本七鳃鳗口腔腺中发现新的CRISP家族成员．对这些CRISP家族成员做简要综述．     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。     

Construction and identification of reverse genetics system of Dengue type 2 virus isolated in China

Dengue (DEN) viruses, mosquito-borne pathogens of the Flavivirus genus, Flaviviridae family, are envel- oped RNA viruses that contain a single-stranded, posi- tive-sense, capped RNA genome of approximately 11 kb. Single polypeptide is co-translationlly pr…     

胞内型磷脂酶A2基因亚克隆与基因表达

目的 研究花生四稀酸在细胞中的释放及前列腺素的合成,构建与花生四稀酸释放相关的表达系统。即胞内型磷脂酶Ａ２（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ｃＰＬＡ２）ｃＤＮＡ－ｐＲＣ／ＣＭＶ。方法 从克隆载体ｐＭＴ２用Ｓａｌ１制备ｃＰＡＬ２ｃＤＮＡ;平末端连接ｃＰＡＬ２－ｐＲＣ／ＣＭＶ;转染鼠巨噬细胞及筛选正向阳性克隆;ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测ｃＰＬＡ２ ｃＤＮＡ基因表达。结果 人ｃＰＬＡ     

编码ATR的胞外区基因cDNA的克隆、测序及表达

目的克隆并在大肠杆菌中表达编码炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor,简称ATR)的胞外区基因。方法收集CHO-K1细胞,提取其总RNA,经反转录成单链cDNA,以此为模板PCR扩增出编码ATR胞外区基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后,亚克隆入表达载体pMal-c2x中进行表达。结果利用所设计的引物扩增出完整的编码ATR胞外区基因。以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的39%。结论获得了编码ATR胞外区基因cDNA及其原核表达产物,为进一步研究炭疽毒素致病机理和炭疽病的防治奠定了基础。     

转录因子E2F—1的DNA结合结构域与GST的融合表达和纯化

通过聚合酶链式反应方法扩增转录因子Ｅ２Ｆ－１中ＤＮＡ结合结构域的基因片段,并将其克隆到ｐＧＥＸ－２Ｔ表达载体中,转化ＢＬ２１菌株．经ＩＰＴＧ诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,其表达量达１５％．经ＧＳＴ－Ａｇａｒｏｓｅ亲合层析,目的蛋白得到了高度纯化．经胶迁移率改变实验（ｇｅｌｓｈｉｆｔｍｏｂｉｌｉｔｙａｓａｙ）证明目的蛋白具有与腺病毒Ｅ２启动子ＤＮＡ片段结合的能力．     

人心室肌球蛋白轻链1基因的克隆及其体外的表达与纯化

通过聚合酶链式反应方法扩增人心室肌球蛋白轻链1的基因片段,并将其克隆到pET-22b质粒,构建表达重组体,转化大肠杆菌BL21细胞,转化子细胞经IPTG诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,凝胶成像扫描检测,其表达量接近细胞总蛋白的40%,经Ni2+亲和层析使目的蛋白得到纯化。     

芸苔EPSPs基因cDNA的克隆和表达载体的构建

作者从芸苔(Brassica campestris)中用RT-PCR方法获得了EPSPs基因的cDNA．与其他物种中的EPSPs基因进行了比对和分析发现：芸苔EPSPs基因的cDNA与欧洲油菜的同源性最高,为93％,与水稻同源性最低,仅为64％．将芸苔EPSPs的ORF片段插入到GTK融合表达载体中,为EPSPs的原核表达奠定了基础。     

hCuZn-SOD基因的克隆、表达及其产物的初步纯化和表征

为获得hCuZn-SOD基因,根据GenBank中人铜锌超氧化物歧化酶(hCuZn-SOD)基因碱基序列,设计扩增引物,用RT-PCR方法从人的肝细胞中克隆出hCuZn-SODcDNA序列,并将它插入pUCm-T载体中,经过DNA序列测定证实,该片段序列的一个碱基发生突变(与报道基因相比),引起其编码第116个氨基酸由G变为D.采用定向克隆的方法将hCu Zn-SOD的cDNA片段克隆到表达载体pGEX-2T上,构建表达质粒pGEX-SOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3).SDS-PAGE分析证实,经IPTG诱导,融合蛋白GST-SOD获得高效表达.破碎菌体、上清经谷胱甘肽亲和层析初步纯化后,得到纯度达90%的目的蛋白.活性实验表明,GST-SOD具有生物活性.     

黄孢原毛平革菌锰过氧化物酶基因（MnP2）的克隆

应用RT-PCR技术,从黄孢原毛平革菌5.766（Phanerochaete chrysosporium）总RNA中成功扩增出预期大小约为1.3 kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入PUC19载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得锰过氧化物酶（MnP2）基因的克隆。序列分析表明,扩增的MnP2基因片段其cDNA长度为1 149 bp,编码358个氨基酸,与其它已发表文献报道的MnP2序列一致,与其同工酶MnP1和MnP3的核苷酸同一性分别为81%和66%。     

Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin

When stimulated with antigen, B cells are influenced by T cells to proliferate and differentiate into antibody-forming cells. Since it was reported that soluble factors could replace certain functions of helper T cells in the antibody response, several different kinds of lymphokines and monokines have been reported in B-cell growth and differentiation. Among these, human B-cell differentiation factor (BCDF or BSF-2) has been shown to induce the final maturation of B cells into immunoglobulin-secreting cells. BSF-2 was purified to homogeneity and its partial NH2-terminal amino-acid sequence was determined. These studies indicated that BSF-2 is functionally and structurally unlike other known proteins. Here, we report the molecular cloning, structural analysis and functional expression of the cDNA encoding human BSF-2. The primary sequence of BSF-2 deduced from the cDNA reveals that BSF-2 is a novel interleukin consisting of 184 amino acids.