绵羊精子冷冻损伤的蛋白质组学研究进展

绵羊冻精技术经过半个多世纪的发展,目前的冷冻效率仍然很低,无法支撑大规模的产业化应用.奶绵羊产业的发展给绵羊冻精和性控冻精的研发和应用提出了新的需求.本文介绍了绵羊精子质膜的构成特点及其对冷冻损伤的影响,论述了经典蛋白质组学技术和高通量定量蛋白质质谱技术在绵羊等家畜精子冷冻损伤研究中的应用及其进展,阐释了开展绵羊精子冷冻损伤的质膜蛋白质组研究的必要性及其最新研究方法,并对绵羊冻精未来的潜在研究方向和应用前景进行了展望.     

大黄鱼精子冷冻复苏后活力和超微结构的变化

大黄鱼精子以甘油为冷冻保存剂,经冷冻-解冻复苏后观察精子的活力和超微结构变化,并进行人工授精,观察冻精的受精能力.实验结果表明,冷冻精子的活力较高(83.1±6.2)%.大部分冷冻精子结构完整,进行人工授精可以获得较高的受精率(71.5±11.6)%.与鲜精对照组比较,仍存在差异(P<0.05).部分冷冻-解冻后的精子结构出现异常,畸形率达到29.3%(P<0.01).较常见的异常是精子质膜膨胀或破损,核膜消失,染色质解体,线粒体嵴消失,轴丝断裂成许多段等.冷冻精子结构异常可能是冻精解冻复苏后精子活力和受精力下降的主要原因.     

不同冷冻方法和解冻液对猪精液冷冻效率的影响

采用三种不同的冷冻方法冷冻猪的新鲜精液,再分别用不同的解冻液在相同条件下同时解冻,对比解冻后精子的活力和顶体完整率,以优化猪精液冷冻方法.实验一:随机选取三头健康的有稳定受精能力的优良种公猪,采集新鲜精液,分别用干冰颗粒、液氮颗粒和液氮细管三种方法冷冻,用同样的方法解冻,对比解冻后精子的活力和顶体完整率;实验二:用不同的解冻液解冻经干冰颗粒法冷冻的精液,对比不同解冻液对精子活力的影响;实验三:以孤雌激活和鲜精受精为对照,验证经实验一和实验二选择出来的最优冷冻方法和解冻液处理后的精子的体外受精能力.实验一显示,干冰颗粒冷冻法冷冻的猪精液解冻后精子活力(0.23)略高于液氮颗粒法的精子活力(0.20),而二者均显著高于细管冻精法的精子活力(0.08)(P<0.05),液氮颗粒法的顶体完整率(54.7%)和细管法的顶体完整率(54.2%)无显著差异,但二者均显著低于干冰颗粒法的顶体完整率(58.0%)(P<0.05).实验二显示,Glucose-EDTA解冻液解冻后,精子活力(0.22)显著高于DPBS-BSA解冻液解冻后的精子活力(0.13)(P<0.05).实验三:经干冰颗粒法冷冻、Glucose-EDTA解冻液解冻的精液,体外受精后的囊胚发育率(17.6%)与鲜精体外受精囊胚率(17.9%)无显著差异,但二者均显著低于孤雌激活对照组的囊胚率(36.6%)(P<0.05).由此可知:干冰颗粒法冷冻结合Glucose-EDTA解冻液解冻是较为理想猪精液冷冻保存方法,经该方法冷冻、解冻的猪精液,体外受精后的胚胎发育率与鲜精没有显著差异.     

OEP、SDS与卵黄的相互作用时间及温度对犬冻融精子质量的影响

人工采取8只优质犬精液,以果糖-Tris-柠檬酸所组成的稀释液为基础,分别于试验前0.5 h和24 h将OEP,SDS和卵黄混合于基础稀释液中,并于5℃冰箱、22℃两个温度条件下保存,用时离心选取上清液作为稀释剂并制成细管冻精.利用流式细胞术和高倍显微镜对犬冻融精子活力、质膜完整率和顶体完整率等特性进行测定,目的在于比较不同温度条件下OEP,SDS和卵黄相互作用时间的长短对犬冻融精子质量的影响,以探讨OEP,SDS对冻融精子的保护作用机理.添加稀释液前24 h混合OEP和卵黄有利于维持冻融过程中质膜完整率(61.5%)和顶体完整率(66.8%),显著提高冻融精子的总活性比率(20.2%),对犬冻融精子的保护效果明显好于相互作用0.5 h实验组的保护效果(P<0.05);OEP,SDS与卵黄相互作用时的温度对犬冻融精子质量无显著影响(P>0.05),OEP对犬冻融精子的保护效果明显优于SDS.结果提示增加OEP,SDS与卵黄相互作用的时间可以提高犬冻融精子的质量.     

洪山公鸡精液冷冻保存方法及效果的研究

研究比较了两种不同类型的冷冻精液在解冻后精子活率、顶体完整率以及受精率方面的差异。实验结果表明,细管型冷冻精液解冻后的活率显著高于颗粒型(n=20,p<0.01)。细管型冷冻精液解冻后的顶体完整率显著高于颗粒型(n=20,p<0.05)。受精实验结果表明,两种类型的冷冻精液的受精率都显著低于以新鲜精液输精的对照组(p<0.01),颗粒型冷冻精液的受精率显著高于细管型冷冻精液(p<0.01)。     

关中驴精子超微结构的观察

利用电子显微超薄切片技术,对关中驴的精子在室温和冷冻保存下的超微结构做了观察,同时还以关中马的精液作了对比。统计分析表明,精子顶体完整率的差异,驴和马的鲜精之间不显著(P>0.05);驴的鲜精和室温保存第2、8、20个小时之间,差异亦不显著(P>0.05),而和保存32、44个小时之间差异显著(P<0.05);冻精和鲜精之间差异十分显著(P<0.001)。室温保存下精子活率的下降与线粒体完整率之间呈相关现象,而冻精无此现象。     

鲤鱼胚胎冷却至-196℃的试验

鱼类胚胎的低温保存是世界范围内尚未解决的课题,在对鲤鱼胚胎低温保存的初步试验中,我们发现在溶液冰点至-60℃范围内,降温速率对胚胎存活率来说是个决定性因素。如降温速率大于0.5℃/min,胚胎很难存活,而最佳降温速率应小于0.07℃/min,对于鱼类胚胎保存而言,慢复温是比较合适的。在我们的试验研究中,若以2.0mol/LDMSO为抗冻剂,降温速率为0.07℃/min,复温速率为8℃/min时,兴国紅鲤尾芽期胚胎经降温至液氮温度(-196℃),并保存一段时间后复温,仍能存活并孵化为幼鱼。试验达到的最大存活率为25%,出苗率为18%。     

运用计算机辅助分析检测超低温保存的真鲷(Pagrosomus major)精子的质量

采用电脑辅助分析(CASA)检测二甲基亚砜(DMSO)作为抗冻剂超低温保存的真鲷精子运动特征及总运动率与受精率、孵化率的关系.以12%-21%DMSO作为保护剂超低温保存2周的精子解冻激活10 s后,运动精子百分率与鲜精的没有显著的差异,而且超低温保存过程没有明显的改变其运动速度和运动方式.然而超低温保存却显著地降低了冻精运动持续的时间,激活后30 s冻精总运动率显著低于鲜精,激活后60 s降至(52.1±9.2)%.我们以标准化的最佳精卵比500∶1对超低温保存的精子进行人工授精实验,发现冻精总运动率与受精率(r=0.869)、孵化率(r=0.826)呈显著的正相关.实验结果显示CASA系统可以客观地检测超低温保存的真鲷精子质量,进一步证明了CASA在精子质量检测中简单、快速、准确的优点,因此该方法在鱼类精子超低温保存研究中具有广阔的应用前景.     

不同解冻方法对辽宁绒山羊精子活力的影响

通过比较三种精液冷冻保存稀释液配方（A、B、C）对山羊细管冷冻精解冻后精子活力的影响,结果表明,三种稀释液配方（A、B、C）,冷冻-解冻后精子活力有极显著的差异（P〈0．01）,分别为42．57％、37．34％、33．03％,A显著优于B液和C液．而且用不同的水浴温度和解冻时间进行解冻,通过精子活力的比较,寻找出最佳的解冻温度为38℃,解冻时间为60s．     

运用计算机辅助分析检测超低温保存的真鲷（Pagrosomus major）精子的质量

采用电脑辅助分析（CASA）检测二甲基亚砜(DMSO)作为抗冻剂超低温保存的真鲷精子运动特征及总运动率与受精率、孵化率的关系.以12%—21% DMSO作为保护剂超低温保存2周的精子解冻激活10s后，运动精子百分率与鲜精的没有显著的差异，而且超低温保存过程没有明显的改变其运动速度和运动方式.然而超低温保存却显著地降低了冻精运动持续的时间，激活后30s冻精总运动率显著低于鲜精，激活后60s降至（52.1±9.2）%.我们以标准化的最佳精卵比500∶1对超低温保存的精子进行人工授精实验，发现冻精总运动率与受精率（r=0.869）、孵化率（r=0.826）呈显著的正相关.实验结果显示CASA系统可以客观地检测超低温保存的真鲷精子质量，进一步证明了CASA在精子质量检测中简单、快速、准确的优点，因此该方法在鱼类精子超低温保存研究中具有广阔的应用前景.     

弓獭蛤受精及早期卵裂过程核相变化的细胞学观察

采用Hoechst 33258染色和荧光显微镜技术,对弓獭蛤(Lutraria arcuata)受精和早期卵裂过程中的核相变化进行观察.其成熟未受精卵呈圆球形,卵径55~60μm,核相处于第1次成熟分裂前期;精子为鞭毛型,全长约50~55μm.精卵混合后,精子迅速附着于卵子表面;受精后10~30 min,精子入卵膨胀成球形;30~50 min进行第1次成熟分裂,排出第1极体;50~60 min进行第2次成熟分裂,排出第2极体;同时精核和卵核体积膨胀,形成雄原核和雌原核;70 min左右,雌、雄原核联合,形成第1次有丝分裂的中期分裂相;70~90 min受精卵进行第1次卵裂,形成2个卵裂球;90~110 min进行第2次卵裂,形成1大3小的4个卵裂球.     

维生素B_(12)对牛冷冻精液精子质量的影响

牛精液冷冻前于精液稀释液中添加ＶＢ１２为试验组，不添加ＶＢ１２的为对照组。冷冻结果表明：试验组冻精解冻后精子活力、顶体完整率分别比对照组提高１６．１１％（Ｐ＜０．０１），１５．９％（Ｐ＜０．０１）；精子畸形率与ＧＯＴ活性均明显下降；精子存活时间延长。说明ＶＢ１２在牛精液冷冻中对牛精子形态结构具有保护作用。     

细胞松弛素B、温度、离心处理对猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻的影响

主要探讨使用CB预处理和不同温度冷冻保护剂对猪卵母细OPS玻璃化冷冻保存的影响,并对使用不同温度冷冻保护剂下,探讨离心猪卵母细胞后的OPS冷冻、解冻的效果.结果表明,体外成熟培养12h后,将经7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)处理的猪卵母细胞进行OPS玻璃化冷冻保存.解冻后继续体外成熟培养,猪卵母细胞的形态正常率和成熟率与对照组无显著差异(P>0.05),但是与对照组相比,经冷冻前经CB预处理的卵母细胞其体外受精胚胎的卵裂率、桑葚胚和囊胚率显著提高(P<0.05).此外,使用预平衡至39℃的冷冻保护剂能够达到较好的解冻效果,卵母细胞成熟率较高,但离心并没有促进冷冻后猪卵母细胞体外受精胚胎发育率.     

小黄鱼精液超低温冷冻保存技术的试验研究

为了研究小黄鱼精液超低温冷冻保存技术,分别比较了3种抗冻剂、3种降温方法和2种复温温度对冷冻精液的影响。结果表明:采用Riger’s液作为稀释液、10%DMSO为抗冻剂,冷冻精液的激活率和受精率最高,与其他两个实验组差异显著(P0.05),分别为92.36%和81.36%;以10℃/min的降温速率将精液降至-80℃后液氮保存,40℃水浴解冻比室温解冻可以获得更好的受精效果,受精率和孵化率分别为78.47%和75.47%。     

高压电脉冲处理对小鼠精子超微结构及体外受精的影响

用电脉冲法处理小鼠精子后进行体外受业有、体外受精贸的卵裂率和桑椹胚发育率都有所降低,以1．0kv/cm,30μs的最佳处理条件处理过的组其卵裂和桑椹胚发育率分别为63．5％和50．9％,与对照组的84．1％和80．0％相比,有显差异（P＜0．01）,说明电脉冲处理对精子受精率和胚胎的体外早期发育有影响。将1．0kv/cm,30μs和4．8kv/cm,90μs电脉冲处理后的精子与正常对照组（离心后重悬于电脉冲缓冲液）的精子分别离心固定后制作电镜切片,观察结果发现,电脉冲处理组的顶体外细胞膜膨胀了膨胀,覆盖顶体的细胞膜隐入,在顶体后区有细胞膜的断裂现象,其变化率分别是：1．0kv/cm,30μs处理组为36．3％;4．8kv/cm,90μs处理组为46．7％,较低电压脉冲处理组精子顶体部分发生了类似顶体反应的变化恩赐 高压电脉冲处理组的线粒体发现了空泡化和线粒体的大小不均一性变化。     

公鸭、公鸡精子对在液氮中低温冷冻保存耐受力的比较研究

比较公鸭和公鸡精子经低温冷冻保存后存活率、顶体完整率方面的差异.结果表明,公鸭冷冻精液解冻后的精子存活率和顶体完整率都不同程度地高于相同类型的公鸡冷冻精液,但差异均未达到显著水准（P＞0.05）.     

体外受精条件对牦牛与黄牛异种受精的影响

本实验通过改变体外受精精子浓度(0.5 × 106、2 × 106、8 × 106 个/mL), 精卵共培养时间(12 h、18 h、24 h), 体外受精96 h后是否更换培养液(IVC)以及氧气的含量(5% CO2 和5% CO2、5% O2、90% N2)等培养条件, 观察牦牛精子对黄牛卵母细胞受精后卵裂和早期胚胎发育状况. 结果显示精子浓度为2 × 106个/mL、精卵共培养24～26 h、培养96h后要更换培养液, 在5% CO2、5% O2、90% N2的条件下培养, 受精和早期胚胎的发育.     

奶牛胚胎简易快速冷冻及其移植试验研究

将7日龄的黑白花奶牛胚胎,采用简易冷冻仪,以液氮作冷冻源的快速冷冻、解冻法对胚胎进行冷冻.甘油作冷冻保护剂,以1℃/min的速度由室温降至-7℃,在-7℃下绣发结晶,并在-7℃下维持5分钟;又以0.3℃/min降到-10℃,最后以0.5℃/min速度降至-30℃,平衡10分钟后,胚胎直接投入液氮罐申保存。需移植时,直接在37℃温水中解冻。本试验解冻了25枚胚胎,取1,2级胚胎15枚,除去甘油后,将15枚胚胎用凯氏枪输卵器分别移植给15头同期受体的的母牛,现已产下3头牛犊.结果表明,采用简易冷冻仪、以液氮作冷冻源的快速冷冻、解冻的胚胎可以成活,且有利在生产实践中推广应用。     

冷冻法卤水脱硝技术改进的研究

采用间歇冷冻法考察了不同降温速率下芒硝晶体粒度及分布情况,研究了芒硝结晶成长速率数学模型.结果表明,在卤水冷冻脱硝过程中通过控制降温速率为0.24℃/min,将过饱和度控制在介稳区内,利于结晶过程的操作,并且可以得到平均粒径为300μm芒硝晶体,以满足芒硝与卤水的沉降分离要求.     

青虾精子超低温冷冻保存技术的研究

本文对青虾精子的超低温冷冻保存技术进行了研究.采用台盼兰染色法检测低温冷冻后青虾精子的活力,研究了3种稀释液(壬氏液,Kurokura extender,D-20)和3种冷冻保护剂(8%DMSO,12.5%甘油,10%甲醇)对青虾精子在超低温冷冻保存时的保护效果,以及不同保存时间后青虾精子活力的变化.结果表明,青虾精子以壬氏液为稀释液,添加8%DMSO作为抗冻保护剂,4℃平衡30 min,-20℃平衡15 min,-80℃平衡15 min后投入液氮中保存,解冻时将冷冻管浸入55℃水浴中10~15 s至半融取出自然解冻,精子能维持60%的存活力.本研究为青虾精子冷冻保存库的建立提供了实验依据和理论基础.