运用计算机辅助分析检测超低温保存的真鲷（Pagrosomus major）精子的质量

采用电脑辅助分析（CASA）检测二甲基亚砜(DMSO)作为抗冻剂超低温保存的真鲷精子运动特征及总运动率与受精率、孵化率的关系.以12%—21% DMSO作为保护剂超低温保存2周的精子解冻激活10s后，运动精子百分率与鲜精的没有显著的差异，而且超低温保存过程没有明显的改变其运动速度和运动方式.然而超低温保存却显著地降低了冻精运动持续的时间，激活后30s冻精总运动率显著低于鲜精，激活后60s降至（52.1±9.2）%.我们以标准化的最佳精卵比500∶1对超低温保存的精子进行人工授精实验，发现冻精总运动率与受精率（r=0.869）、孵化率（r=0.826）呈显著的正相关.实验结果显示CASA系统可以客观地检测超低温保存的真鲷精子质量，进一步证明了CASA在精子质量检测中简单、快速、准确的优点，因此该方法在鱼类精子超低温保存研究中具有广阔的应用前景.     

关中驴精子超微结构的观察

利用电子显微超薄切片技术,对关中驴的精子在室温和冷冻保存下的超微结构做了观察,同时还以关中马的精液作了对比。统计分析表明,精子顶体完整率的差异,驴和马的鲜精之间不显著(P>0.05);驴的鲜精和室温保存第2、8、20个小时之间,差异亦不显著(P>0.05),而和保存32、44个小时之间差异显著(P<0.05);冻精和鲜精之间差异十分显著(P<0.001)。室温保存下精子活率的下降与线粒体完整率之间呈相关现象,而冻精无此现象。     

大黄鱼精子冷冻复苏后活力和超微结构的变化

大黄鱼精子以甘油为冷冻保存剂,经冷冻-解冻复苏后观察精子的活力和超微结构变化,并进行人工授精,观察冻精的受精能力.实验结果表明,冷冻精子的活力较高(83.1±6.2)%.大部分冷冻精子结构完整,进行人工授精可以获得较高的受精率(71.5±11.6)%.与鲜精对照组比较,仍存在差异(P<0.05).部分冷冻-解冻后的精子结构出现异常,畸形率达到29.3%(P<0.01).较常见的异常是精子质膜膨胀或破损,核膜消失,染色质解体,线粒体嵴消失,轴丝断裂成许多段等.冷冻精子结构异常可能是冻精解冻复苏后精子活力和受精力下降的主要原因.     

真鲷精液和精巢超低温冷冻保存

以精子的活率和游动时间为指标，研究了福建南部沿海秋冬季真鲷生殖群体精液和精巢超低温冷冻保存的方法和鲜精在不同盐度或酸碱度条件下的生理特性．结果表明，以０．８％的ＮａＣｌ和０．０５％的ＫＣｌ配制的稀释液适合于真鲷精液的冷冻保存．Ｋ＋有助于提高精子的活率．添加甘氨酸可延长精子的游动时间．甘油、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）和甲醇均可作为真鲷精液的抗冻保护剂，但以甘油和ＤＭＳＯ混合使用时的抗冻效果较好．冷冻精液的效果优于冷冻精巢．鲜精在弱碱环境和盐度为３０时平均活率最高，游动时间最长．     

小黄鱼精液超低温冷冻保存技术的试验研究

为了研究小黄鱼精液超低温冷冻保存技术,分别比较了3种抗冻剂、3种降温方法和2种复温温度对冷冻精液的影响。结果表明:采用Riger’s液作为稀释液、10%DMSO为抗冻剂,冷冻精液的激活率和受精率最高,与其他两个实验组差异显著(P0.05),分别为92.36%和81.36%;以10℃/min的降温速率将精液降至-80℃后液氮保存,40℃水浴解冻比室温解冻可以获得更好的受精效果,受精率和孵化率分别为78.47%和75.47%。     

光唇鱼精子的活力观察

通过测定精子的激活率、运动时间及寿命,研究了几种因子对光唇鱼精子活力的影响。结果表明,光唇鱼精子激活与运动的适宜pH为6.5～8.0;pH 7.0时,精子激活率达（93.33&#177;2.89）%、运动时间达（30.33&#177;1.53）s。精子在0.4%g/L NaCl溶液中的激活率达（93.67&#177;1.15）%,运动时间及寿命分别达（36.00&#177;1.00）s及（44.67&#177;1.53）s。精子在0.7%g/L KCl溶液中的激活率、运动时间及寿命分别达（93.33&#177;2.89）%、（55.33&#177;1.53）s及（65.33&#177;2.31）s。精子在（0.1～1.0）%g/L的葡萄糖溶液和CaCl2溶液中均不能激活。精子在室温28～30℃下存放3 h后活力明显下降,在低温4℃下存放5 h后活力与鲜精相比无显著差异。CF-HBSS液及1.0%g/L NaCl溶液可作为精子保存用稀释液。     

高山红景天花粉的超低温保存

对来自大兴安岭、长白山的高山红景天花粉进行了超低温保存研究。结果表明:不同的干燥时间对超低温保存后花粉萌发力有明显影响,12 h干燥处理的花粉萌发力明显高于8 h、24 h干燥处理的;用0℃(8 h)→-10℃(8 h)→-20℃(8 h)变温预冻处理能大幅提升超低温保存后花粉的萌发力;超低温保存后的解冻方式以-20℃(8 h)→4℃(8 h)→25℃(8 h)为最佳。     

太平洋牡蛎精液的超低温保存

利用解剖法采集太平洋牡蛎精液，用自然海水做基础溶液，配制不同浓度的DMSO（二甲亚砜）作为超低温保护剂，在液氮（LN2）面上不同高度进行预处理,投入LN2内保存，升温解冻后，检测精子成活率。结果表明，DMSO处理浓度、预处理温度及时间和升温方式对超低温保存成活率均具有显著影响。其中，用10％DMSO在LN2面上17cm预处理6min，采用16－17℃流水不完全解冻，效果最好，超低温保存精子成活率可达70％。与新鲜精子相比，在LN2内保存一天的精子，授精能力没有明显变化。     

皱纹盘鲍精子的激活及超低温保存研究

用不同浓度的氨海水激活解剖获得的皱纹盘鲍精子并进行激活率和受精率的测定.以自然海水作基础溶液,以二甲基亚砜(DMSO)和甘油(Gly)做保护剂,在不同降温程序下,将解剖获得和经诱导自然排放的皱纹盘鲍精子置于液氮罐中保存24 h,解冻后检测精子的成活率.结果表明,加入自然海水后有64.27%的解剖精子被激活,但不能受精,经氨海水处理后的精子在0.02‰浓度条件下激活率和受精率最高,分别为85.60%、67.42%.自然排放和解剖获得的精子在14%DMSO、4℃平衡15 min,-20℃时平衡5min,-80℃时平衡5 min条件下精子存活率最高,分别为48.15%和64.01%.     

不同降温速率对奶绵羊冻后精子质膜和线粒体膜完整性的影响

冻精的生产和应用可充分保存和利用优秀种畜的遗传资源并加快品种改良进程.然而,目前绵羊的冻精技术体系还不完善.戴瑞羊(DairyMeade)是国内引进的新型乳用绵羊品种,为建立适用于戴瑞羊的细管冻精生产方案,本研究选用3只18月龄的戴瑞种公羊(N1、N2、N3),在冷冻曲线的-10℃～-100℃危险温区内设置8个降温速率(30℃/min～100℃/min,间隔10℃/min),利用程序化冷冻仪生产细管冻精,并比较了冻后精子的质膜完整率、线粒体膜完整率和IVF后的胚胎卵裂率.结果显示:1)N1羊60℃/min、70℃/min和80℃/min三个降温速率下冻后精子质膜完整率无显著差异,但显著高于其他5个降温速率组(P0.05); N2与N3羊60℃/min降温速率下的冻后精子质膜完整率与80℃/min组差异不显著,但显著高于其他6个降温速率组(P0.05); 2)三只羊60℃/min降温速率下冻后精子的线粒体膜完整率与70℃/min降温速率组无显著差异,但显著高于其他6个降温速率组(P0.05); 3)60℃/min组冻后精子体外受精后的胚胎卵裂率最高.结果表明,在-10℃～-100℃降温区间内60℃/min的降温速率可获得质量较好的戴瑞羊细管冻精.本研究为戴瑞奶绵羊冻精程序的优化提供了理论依据.     

不同冷冻方法和解冻液对猪精液冷冻效率的影响

采用三种不同的冷冻方法冷冻猪的新鲜精液,再分别用不同的解冻液在相同条件下同时解冻,对比解冻后精子的活力和顶体完整率,以优化猪精液冷冻方法.实验一:随机选取三头健康的有稳定受精能力的优良种公猪,采集新鲜精液,分别用干冰颗粒、液氮颗粒和液氮细管三种方法冷冻,用同样的方法解冻,对比解冻后精子的活力和顶体完整率;实验二:用不同的解冻液解冻经干冰颗粒法冷冻的精液,对比不同解冻液对精子活力的影响;实验三:以孤雌激活和鲜精受精为对照,验证经实验一和实验二选择出来的最优冷冻方法和解冻液处理后的精子的体外受精能力.实验一显示,干冰颗粒冷冻法冷冻的猪精液解冻后精子活力(0.23)略高于液氮颗粒法的精子活力(0.20),而二者均显著高于细管冻精法的精子活力(0.08)(P<0.05),液氮颗粒法的顶体完整率(54.7%)和细管法的顶体完整率(54.2%)无显著差异,但二者均显著低于干冰颗粒法的顶体完整率(58.0%)(P<0.05).实验二显示,Glucose-EDTA解冻液解冻后,精子活力(0.22)显著高于DPBS-BSA解冻液解冻后的精子活力(0.13)(P<0.05).实验三:经干冰颗粒法冷冻、Glucose-EDTA解冻液解冻的精液,体外受精后的囊胚发育率(17.6%)与鲜精体外受精囊胚率(17.9%)无显著差异,但二者均显著低于孤雌激活对照组的囊胚率(36.6%)(P<0.05).由此可知:干冰颗粒法冷冻结合Glucose-EDTA解冻液解冻是较为理想猪精液冷冻保存方法,经该方法冷冻、解冻的猪精液,体外受精后的胚胎发育率与鲜精没有显著差异.     

药用植物种质资源超低温保存研究

针对我国药用植物资源因过度采挖导致产量逐年递减的现状,从超低温保存原理、超低温保存基本程序、超低温保存后材料细胞相对存活率测定及其遗传稳定性检测等方面对药用植物种质资源超低温保存技术的研究现状进行了分析与总结.     

超低温保存脱除两种马铃薯病毒

采用超低温保存的方法对马铃薯病毒PVY和PVS进行了脱除研究.结果显示:经过超低温保存后,材料的存活率可达71.6%,比传统的茎尖培养脱毒材料的成活率在52%左右高;超低温保存后PVY病毒脱除率达到83%,比传统脱毒方法脱毒率(62%)和热处理脱毒率(65%)要高,且操作上也较简单;对于马铃薯PVS病毒脱除率在47%左右,而采用茎尖培养病毒的脱除率仅有17%左右.     

细叶小羽藓孢子的超低温保存

通过对干燥时间及预处理温度等超低温保存条件的实验探索,筛选出细叶小羽藓(Haplocladium microphyllum)孢子超低温最适保存条件,利用最适保存条件对细叶小羽藓孢子进行不同时间(1 d、15 d、30 d、90 d、180 d)的超低温保存研究,并与未经任何处理直接投入液氮的孢子进行比较.结果表明:(1)细叶小羽藓孢子在硅胶干燥5 h、-20℃低温预处理和室温自来水化冻的条件下的平均萌发率最高(88.26%),干燥20 h、常温处理的孢子与干燥5 h、-20℃低温预处理的孢子平均萌发率差异不显著;(2)液氮保存1 d后的孢子平均萌发率(88.26%)高于未用液氮保存的孢子平均萌发率(77.90%),保存30 d后的孢子平均萌发率降为6.03%,而保存90 d后平均萌发率又出现上升的趋势,达到88.47%,保存180 d后平均萌发率仍维持在49.46%,相对保持率为63.49%.因此,使用液氮超低温长期保存细叶小羽藓孢子是可行的.     

七叶树种子离体胚的超低温保存

通过对七叶树种子离体胚超低温(-196 ℃)保存后生活力、相对电导率和脱氢酶活性的测定分析,初 步研究其长期保存的可行性。结果表明：含水率是影响七叶树种子离体胚超低温保存的重要因素,超低温 保存时应对种子进行适度脱水。超低温保存后,七叶树离体胚生活力最高为93 %,其处理组合中57.3 %含 水率+缓速冷冻+快速解冻+10 %二甲基亚砜+10 %蔗糖+20 %聚乙二醇为最佳处理方案。     

超低温保存下藓类植物孢子萌发率的变化:以6种藓类植物为例

为了检验苔藓植物孢子超低温保存方法的适用性,该文对采自不同生境中的6种藓类孢子超低温保存前的干燥时间和低温预处理进行探索,并在最适处理条件下对其中5种藓类孢子进行不同时间梯度(1 d、15 d、30 d、90 d和180 d)的超低温保存研究.结果表明:①经过干燥和低温预处理后,6种藓类孢子的最高萌发率均维持在较高水平(87.25%～96.21%);②与低温预处理相比,干燥处理在孢子超低温保存中更为关键.孢子在只进行干燥处理情况下其最高平均萌发率为74.97%～96.21%,而只对其进行低温预处理时的最高平均萌发率变化较大,从21.73%到90.94%;③5种藓类孢子在液氮保存1 d后的平均萌发率均最高(87.25%～96.21%),且随着保存时间的延长,所有藓类孢子的萌发率都有所下降,但仍维持在相对较高的水平(73.69%～86.60%);④葫芦藓、丝瓜藓和长蒴藓孢子在保存30 d后萌发率分别为86.49%、86.60%和84.98%,卵蒴真藓和丛生真藓孢子在保存180 d后萌发率仍可达到73.69%和84.17%.研究表明,藓类孢子非常适合于超低温保存,而且可能代表一种简单、稳定、高效的苔藓植物种质资源保存材料.     

青虾精子超低温冷冻保存技术的研究

本文对青虾精子的超低温冷冻保存技术进行了研究.采用台盼兰染色法检测低温冷冻后青虾精子的活力,研究了3种稀释液(壬氏液,Kurokura extender,D-20)和3种冷冻保护剂(8%DMSO,12.5%甘油,10%甲醇)对青虾精子在超低温冷冻保存时的保护效果,以及不同保存时间后青虾精子活力的变化.结果表明,青虾精子以壬氏液为稀释液,添加8%DMSO作为抗冻保护剂,4℃平衡30 min,-20℃平衡15 min,-80℃平衡15 min后投入液氮中保存,解冻时将冷冻管浸入55℃水浴中10~15 s至半融取出自然解冻,精子能维持60%的存活力.本研究为青虾精子冷冻保存库的建立提供了实验依据和理论基础.     

细针睾丸抽吸精子加卵胞浆内单精子显微注射的临床研究

目的 :探讨细针睾丸抽吸精子加卵胞浆内单精子显精注射(ICSI)的临床价值。方法 :本中心采用控制性超排卵方案并使用改良的显微操作系统 ,对6例(6个周期)梗阻性无精子症患者经细针睾丸抽吸精子加ICSI术治疗。结果 :其受精率、优质胚胎率和临床妊娠率分别为(60/76)、(38/60)、(4/6)。结论 :经细针睾丸抽吸精子加ICSI是治疗梗阻性无精子不育症的有效方法。     

OEP、SDS与卵黄的相互作用时间及温度对犬冻融精子质量的影响

人工采取8只优质犬精液,以果糖-Tris-柠檬酸所组成的稀释液为基础,分别于试验前0.5 h和24 h将OEP,SDS和卵黄混合于基础稀释液中,并于5℃冰箱、22℃两个温度条件下保存,用时离心选取上清液作为稀释剂并制成细管冻精.利用流式细胞术和高倍显微镜对犬冻融精子活力、质膜完整率和顶体完整率等特性进行测定,目的在于比较不同温度条件下OEP,SDS和卵黄相互作用时间的长短对犬冻融精子质量的影响,以探讨OEP,SDS对冻融精子的保护作用机理.添加稀释液前24 h混合OEP和卵黄有利于维持冻融过程中质膜完整率(61.5%)和顶体完整率(66.8%),显著提高冻融精子的总活性比率(20.2%),对犬冻融精子的保护效果明显好于相互作用0.5 h实验组的保护效果(P<0.05);OEP,SDS与卵黄相互作用时的温度对犬冻融精子质量无显著影响(P>0.05),OEP对犬冻融精子的保护效果明显优于SDS.结果提示增加OEP,SDS与卵黄相互作用的时间可以提高犬冻融精子的质量.     

解脲支原体感染对不育男性精液质量的影响

目的:研究解脲支原体(UU)感染对不育男性精液质量的影响.方法:收集不育男性精液143例,分为UU阳性的观察组46例和UU阴性的对照组97例;采用西班牙CASA计算机辅助分析系统分析精子活力,通过伊红染色法检测精子存活率,精子形态染色则采用标准巴氏法,精子顶体酶活性、表面结合抗体As Ab水平、精浆弹性蛋白酶水平均采用试剂盒进行检测.结果:与对照组相比,UU感染组精子正常形态率显著降低(P0.05),而顶体酶异常率显著升高(P0.05);精子前向运动率、总活力、存活率及顶体酶活性降低,但无统计学差异(P0.05);精子畸形指数、畸形精子指数、As Ab水平及精浆弹性蛋白酶水平均无统计学差异(P0.05).结论:UU感染可导致精子正常形态率显著降低,顶体酶异常率显著升高,从而使男性不孕率升高;同时,UU感染亦可能影响精子活动率、存活率、顶体酶活性、As Ab水平及精浆弹性蛋白酶水平.