大肠杆菌O96 O-抗原基因簇的破译和特异基因的鉴定

大肠杆菌O96血清型的大肠杆菌近年来频繁地出现于分离到的致病菌株中,在发展中国家和发达国家均有发现,有造成爆发性流行的可能．本文利用鸟枪法对大肠杆菌O960～抗原基因族进行测序,序列全长9415bp,用生物信息学的方法进行序列分析,共发现7个基因,分别是：吡喃型UDP-半乳糖变位酶基因(glf),O-抗原转运酶基因(wzx),O-抗原聚合酶基因(wzy)和糖基转移酶基因(4个)．本文分析了大肠杆菌O96和K12(016)的O-抗原基因族中吡喃型UDP-半乳糖变位酶基因和O-抗原转运酶基因的进化关系,确定了吡喃型UDP-半乳糖变位酶的基序;用PCR的方法筛选出了2个针对大肠杆菌O96的特异基因,可以用于基因芯片或PCR方法快速检测大肠杆菌O96。     

福氏志贺菌ipaC基因的克隆及序列分析

为了克隆福氏志贺氏菌的ipaC基因，以志贺氏菌福氏2a菌株为摸板进行PCR，并将PCR产物插入列pMD-T载体中，得到阳性重组子，并命名为pMD-ipaC．测序结果显示，其核苷酸序列与文献报道的序列有差异，但编码的氨基酸序列相同，表明志贺氏菌的ipaC基因已被成功克隆．     

乳粉中常见致病菌的多重荧光PCR检测

利用多重荧光PCR技术快速检测乳粉中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌.以沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因为靶基因,选择特异性引物,以参照菌种为对象,验证引物的特异性,建立多重荧光PCR检测方法,人工添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌,确定方法的检出限.结果表明该方法特异性强、灵敏度高,乳粉中检测的灵敏度为1CFU/mL,可在8h内完成对乳品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的检测.     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3CFU/mL;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8CFU/mL。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

痢疾杆菌膜表面抗原分析

采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ＃胶电泳和免疫印迹技术（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）对痢疾杆菌膜表面抗原进行了分析，测定了主要蛋白的分子量。依电泳凝胶染色和免疫印迹图谱，分析了痢疾菌４个群的主要抗原及福氏菌的群特异性抗原和两个型的型特异性抗原，并比较了志贺氏菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）实验选用菌株的抗原蛋白。同时，对几种菌的生长曲线进行了测定。     

应用PCR技术检测志贺氏菌

建立一种快速检测志贺氏菌PCR检测方法。根据志贺氏菌的侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,设计引物,建立PCR检测方法。本方法特异性高,均能检测出志贺氏菌属的4个种,整个实验过程8～10h完成。建立的方法可用与实际检测。     

苏云金芽孢杆菌cry1基因的PCR-RFLP鉴定分析

利用PCR—RFLP技术对含有已知cry1基因的8株标准菌株和2株遗传工程菌进行了基因分析，证实了该方法的可行性．并在此基础上鉴定了分离保藏的70株B．t菌株的cry1型基因，结合SDS—PAGE分析以及室内生物测定结果，讨论了基因型与蛋白表达及毒力之间的关系．     

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR方法的建立

目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因、假结核耶尔森氏菌inv基因、志贺氏菌ipa H基因及空肠弯曲菌gyr A基因设计并筛选出特异性引物;优化退火温度等条件,分析多重PCR的特异性、敏感性,使用该多重PCR方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌(511 bp)、假结核耶尔森氏菌(779 bp)、志贺氏菌(290 bp)和空肠弯曲菌(156 bp)。该方法的灵敏度为1×10-3ng/μL(小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌)和1×10-2ng/μL(空肠弯曲菌)。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCR方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。     

痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)对荷瘤小鼠免疫保护及作用机制初报

本文以荷瘤小鼠为模型,初步观察了痢疾志贺氏菌（Ｓｈ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）的抗瘤作用。结果显示：痢疾志贺氏菌能显著抑制ＤＢＡ小鼠的移植性肿瘤Ｌ５１７８Ｙ、Ｐ８１５的生长,提高荷瘤小鼠的生存率,痢疾志贺氏菌还能提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬细胞和脾脏ＮＫ细胞杀瘤活性。痢疾处理的荷瘤小鼠脾脏及腹腔渗出非粘附细胞无杀瘤活性,而痢疾处理的荷瘤小鼠脾脏非粘附细胞和经痢疾处理的正常小鼠腹腔巨噬细胞混合后可表现出协同杀瘤活性,且是特异性杀瘤     

沙葱多糖的体外抑菌试验研究

采用琼脂扩散法比较了沙葱多糖(SCSP)、沙葱鲜汁及黄芪多糖(HQSP)在体外对大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、普通变形杆菌的抑菌作用.结果表明20 mg/mL和40 mg/mL的SCSP对以上6种细菌均有一定的抑制作用,但两者之间的作用效果无显著性差异(P>0.05),SCSP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较为明显,最大抑菌圈直径分别为13.3 mm、9.9 mm;HQSP对以上6种细菌均无任何抑制作用;沙葱鲜汁的抑菌效果最为显著,对6种细菌均有较强的抑制作用,抑菌圈直径均≥8 mm,尤其对肠道细菌痢疾志贺氏菌的抑菌效果更为显著,最大抑菌圈直径为21.2 mm.     

口蹄疫抗原决定簇融合基因转化水稻的研究

将口蹄疫O型抗原决定簇和A型抗原决定簇构成的融合基因O21-O18-A21经农杆菌介导转入粳稻品种日本晴中．经潮霉素筛选．获得再生植株207株．提取它们的总DNA进行PCR检测．其中193株扩增出和阳性对照相同的900bp和450bp两条带．转基因阳性率达93．2％．抽取部分阳性植株进行PCR—Southern杂交检测及报告基因GUS检测．同样证明融合基因已经整合到日本晴基因组中．     

深海沉积物中产淀粉酶细菌的rep—PCR基因指纹分析

利用淀粉酶筛选培养基平板从27个深海沉积物样品中筛选得到30个具有胞外淀粉酶活性的菌株．其中革兰氏阴性细菌有22株．阳性细菌有8株．对这些细菌的基因组DNA进行ERIC—PCR和BOX—PCR扩增．指纹图谱显示大部分菌株均存在数目不等的各自独特的带型．各特异性扩增的主带型能重复稳定出现．比较两种引物的指纹图谱．显示ERIC—PCR比BOX—PCR具有较丰富的图谱多态性．对产生的指纹图谱进行聚类学分析．30株细菌可分为10组．其中5株细菌分别独立成组．最多的第Ⅱ组包含有8株细菌．而在同一聚类组内的细菌可能是处于进化上亲缘关系较近的位置．研究显示，30株菌具有丰富的种属多样性．揭示了深海微生物资源的丰富和潜力．ERIC—PCR和BOX—PCR技术可用于对深海微生物群落组成和多样性的研究．     

变性高效液相色谱检测霍乱弧菌

变性高效液相色谱（DHPLC）是近几年刚发展起来的一种快速检测PCR扩增产物的新技术．应用该技术快速检测O1、O139、非O1、非O139群霍乱弧菌的外膜蛋白基因（ompW）．根据霍乱弧菌外膜蛋白基因的特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC进行快速检测．以54株参考菌株做特异性检测．在丹东口岸国境外环境水体采集水样310份,以PCR—DHPLC和常规分离培养进行了比较,对丹东口岸国境外环境水体霍乱弧菌感染状况进行了检测,并对分离株进行了ompW基因测序．试验结果表明该方法有很好的特异性,310份水样中经PCR—DHPLC检测出58株霍乱弧菌的分菌株,阳性率为19％,与常规分离培养比较,符合率为100％．分离株的ompW序列与Genbank中的存在1％～3％的差异．这种检验方法特异性强,简便快捷,为霍乱防治提供了一种有效的检测新手段．     

口蹄疫抗原决定簇融合基因转化胡萝卜的研究

利用转基因植物生产疫苗是目前植物基因工程的一个研究热点，具有生产简单、成本较低、使用安全方便、易贮存等优点．本实验通过农杆菌介导的遗传转化．以O型和A型口蹄疫抗原决定簇基因O21-O14-A21转化胡萝卜．通过筛选．获得潮霉素抗性愈伤组织。经胚状体再生得到156棵抗性苗．通过GUS染色检测．GUS报告基因在部分转化的愈伤组织中瞬时表达．并在部分抗性苗中稳定表达．对部分抗性植株进行PCR和PCR—Southern杂交检测．证实目的基因已经成功整合到胡萝卜基因组中．     

传染性法氏囊病快速诊断技术的建立及其应用

根据已发表的IBDV各致病型毒株的序列，在病毒结构蛋白VP2编码基因的高变区(VP2 variable domain,vVP2)两端外侧的保守序列内设计合成了2条寡核苷酸引物，对各种不同致病型的12株参考毒株进行逆转录酶一聚合酶链式反应(RT—PCR)的检测．结果 12个参考毒株均能扩增出约679 bp的目的片段，而对作为阴性对照的常见5种鸡病病原NDV、IBV、CAIV、E．coli、pM均没有扩增出任何片段；应用建立的技术对疑似IBD的34份临床病料进行检测，并同时在基础RT—PCR扩增的片段内设计另一对引物进行Nested—PCR检测．结果基础RT—PCR方法检测到ll份阳性，Nested-PCR检测到23份阳性．研究的结果表明建立的IBD的RT—PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点．在此基础上设计的Nested—PCR则大大提高了阳性检出率(提高52．1％)．     

李坏死环斑病毒检测方法的比较研究

针对感染李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）植株病毒的特异性检测,将DAS—ELISA、RT—PCR方法综合改进、优化,建立了免疫捕获反转录PCR（IC—RT—PCR）检测PNRSV的方法．该方法采用PNRSV抗体特异性免疫捕获病毒,并根据GenBank中PNRSV序列设计的特异性引物对PNS／PN3进行PCR扩增,得到约760bp大小的特异性基因片段．扩增产物经克隆测序后,结果表明：产物序列与PNRSV的外壳蛋白编码基因存在94％～98％的同源性．检测广泛性以及灵敏度比较研究显示,IC—RT—PCR方法能从含量很低的受病样品中检出PNRSV,检测灵敏度与RT—PCR相近,但所检测样品的范围更广,适用于从植物各部位检测低含量的病毒．IC—RT—PCR检测灵敏度比DAS—ELISA方法高出1000倍．     

肝片吸虫保护性抗原基因在卡介苗中的表达

用ECoR　I酶切合肝片吸虫保护性抗原基因FH3的重组质粒pUC18／FH3，回收FH3(约1．0kb)片段并测定其碱基序列．FH3片段以正确相位插入到E．coli—分枝杆菌穿梭表达质粒载体pMV261中，构建含有肝片吸虫保护性抗原基因的重组穿梭质粒．通过电转移法转化卡介苗，斑点杂交实验汪明，重组卡介苗中含有此抗原基因．热诱导FH3基因在卡介苗中的表达，并对基图表达产物进行别SDS—PAGE分析．结果显示，表达产物相对分子量为22kD．     

轮状病毒VP7基因的克隆及核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增了916bp的VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5a中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定，证明重组质粒pT-V7中含有轮状病毒的VP7基因片段。经核苷酸序列分析，表明正确克服了轮状病毒主要保护性抗VP7基因中抗原表位区。     

肝癌肿瘤抗原SMP——30融合蛋白的表达及纯化

用两种不同的表达载体构建、表达人肝癌肿瘤抗原——衰老标记蛋白-30(SMP-30),并在体外对其表达产物进行纯化和鉴定。PCR方法扩增经SEREX技术筛选出的人肝细胞癌抗原SMF-30羧基末端165个AA的DNA序列,分别与pMAL-C2和pET16b两种表达载体重组后转入相应的宿主菌中诱导表达,并对表达产物进行分离纯化和鉴定。结果克隆的SMP-30基因经DNA测序与已公布的序列相同。pMAL—C2和pET16b两种重组载体分别表达出带麦芽糖结合蛋白和带10个组氨酸的SMP-30融合蛋白,麦芽糖结合蛋白——SMF-30是以可溶性蛋白形式表达,而带组氨酸的SMP-30则以包涵体的形式存在,对表达蛋白质N-末端15个氨基酸进行测序,结果与预期的完全相同。结果说明pMAL—C2表达载体更为适合于SMP-30蛋白质的表达;实验为肿瘤抗原免疫研究打下了基础。     

血吸虫膜相关抗原基因的克隆

目的:筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,S.japonicum)新的疫苗候选抗原基因.方法:以S.japonicum成虫DNA为模板,PCR扩增相关基因,然后将其克隆XpBS-T载体,通过菌落PCR对产物进行检测,对阳性克隆子测序,与GeneBank中的已知相关序列进行比对分析.结果:菌落PCR获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明PCR产物与S.japonicum 22.6 kDa抗原分子核苷酸序列具有高度同源性.其目的基因大小636 bp,具有一个189 bp的ORF,能编码63个氨基酸.ORF不是全长的阅读框,只获得部分编码区.表达产物可含有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段(25～33位)和一个酪氨酸激酶磷酸化位点(38～39位).讨论:成功克隆出一个与S.japonicum 22.6kDa抗原编码基因有高度同源性的基因.预测该基因为膜相关蛋白基因,可编码血吸虫体表膜相关蛋白.在生理机能上,该膜相关蛋白可能是信号传递分子.