点突变ras癌基因全cDNA真核表达重组体的构建及诱导NIH…

将活化癌基因Ｔ２４－ｒａｓ的ｃＤＮＡ序列正向插入真核载体ｐＭＡＭｎｅｏ，构建成重级同粒ｐＭＡＭｎｅｏ－Ｔ２４－ｒａｓ，将该质粒转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，通过药物筛选，建成细胞系３Ｔ３（Ｔ２４）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明外源Ｔ２４－ｒａｓ基因已整合于受体细胞染色体中，３Ｔ３（Ｔ２４）细胞表现出形态学方面的明显变化；具失去接触抑制能力，且在裸鼠体内致瘤等恶性行为，本文构建的Ｔ２４－ｒａｓ基因真核表达重组体和     

研究聚ADP核糖基化作用与细胞恶变关系的双基因真核表达重…

本文将聚ＡＤＰ核糖聚合酶基因１．４ｋｂ部分序列反向插入真核表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ和ｐＳＭＧ中，同时１２位密码子突变的活化ｒａｓ癌基因也一同克隆到上述载体中，从而获得具有不同真核基因筛选标记的双基因真核表达重组ｐＭＡＭｎｅｏ－Ｃｌ．４－Ｔ２４，ｐＭＡＭｎｅｏ－Ｃｌ．４－ａｒＴ２４，及ｐＳＭＧ－Ｃｌ．４－Ｔ２４，上述质粒的构建成功为研究聚ＡＤＰ核糖基化作用与细胞恶变的关系提供了一种新的分子模型。     

降低聚腺苷二磷酸核糖聚合酶活性对外源癌基因诱导的NIH3T3转化的逆转作用研究

用ＰＡＲＰ酶抑制剂苯甲酰胺（ＢＡ）处理经ｃ－Ｈａ－Ｔ２４－ｒａｓ活化癌基因转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞得到转化细胞系，结果表明：经苯甲酸胺处理的细胞系，其细胞凝集、血清依赖性、形态特征等均发生了改变，呈现出正常细胞的特征．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，已整合到细胞基因组中的外源Ｔ２４～ｒａｓ基因发生了丢失．     

降低聚腺苷二磷酸核糖聚合酶活性对外源癌基因诱导的NIH…

用ＰＡＲＰ酶抑制剂苯甲酰胺（ＢＡ）处理经ｃ－Ｈａ－Ｔ２４－ｒａｓ活化癌基因转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞得到转化细胞系，结果表明，经苯甲酰胺处理的细胞系，其细胞凝集，血清依赖性，形态特征等均发生了改变呈出现正常细胞的特征，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，已整合到细胞基因组中的外源Ｔ２４－ｒａｓ基因发生了丢失。     

逆转录病毒载体介导的Anti-ras核酶对T24ras转化3T3细胞的抑制作用

突变ｒａｓ基因存在于多种人类肿瘤细胞中,本文将可特异性切割１２位点突变ｒａｓ（Ｔ２４ｒａｓ）之核酶Ｒ８通过逆转录病毒载体导入Ｔ２４ｒａｓ转化的ＮＩＨ３Ｔ３细胞,以期检测核酶在细胞内对其靶基因的作用．结果表明Ｒ８可特异性地切割突变ｒａｓｍＲＮＡ,导致转化细胞生物学特性如细胞形态、生长速度等在一定程度上发生逆转     

逆转录病毒载体介导的Anti—ras核酶对T24ras转化3T3细胞 …

突变ｒａｓ基因存在多种人类肿瘤细胞中，本文将可特异性切割１２位点突变ｒａｓ（Ｔ２４ｒａｓ）之核酶Ｒ８通过逆转录病毒载体导入Ｔ２４ｒａｓ转化的ＮＩＨ３Ｔ３细胞，以期检测核酶在细胞内对其靶基因的作用，结果表明Ｒ８可特异性地切割突变ｒａｓｍＲＮＡ导致转化细胞生物学特性的细胞形态，生长速度等在一定程度上发生逆转。     

电击法转移含人凝血因子IX基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒颗粒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者合ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动于控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动于驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１０８０细胞中的ＦＩＸ表达量分别为２２０、２１２ｎｇ／（１０６细胞·２４ｈ）通过与ｐＣＭＶＩＸ共转染靶细胞，可以增加人ＩＸ因子表达１．５～３．５倍，显示了用质粒载体转染靶细胞在血友病Ｂ基因治疗中是一条潜在可行的途径．本项研究用自制的电击仪转移ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０等细胞，最高的转移效率达１０－３，并探讨了细胞种类，ＤＮＡ量，ＤＮＡ结构，电压，脉冲时间与转移效率及表达量的关系．     

蓝细菌新质粒载体pPRS－1的构建

以蓝细菌Ｐｌｅｃｔｃｎｅｍａｂｏｒｙａｎｕｍ内源小质粒ｐＰｂｓ（１．５ｋｂ）和Ｅ。ｃｏｌｉ质粒载体ｐＢＲ３２２（４．３ｋｂ）为材料，用限制性内切核酸酶ＣｌａⅠ分别消化，经Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞，在含Ａｍｐ（Ａｐ）和含Ｔｅｔ（Ｔｃ）的ＬＢ琼脂培养基上筛选出Ａｍｐ￣ｒＴｅｔ￣ｓ的转化子，提取转化子的质粒，用ＣｌａⅠ消化，得１．５ｋｂ和４．３ｋｂ两片段，表明转化子所含质粒是ｐＰｂｓ和ｐＢＲ３２２的重组质粒，定名为ｐＰＲＳ－１。     

小麦叶绿体psbA基因的克隆及表达

用ＰＣＲ直接从小麦叶绿体基因组扩增到完整的ｐｓｂＡ基因，并构建了ｐｓｂＡ基因的克隆ｐＴＤ１Ⅱ。为研究ｐｓｂＡ基因在Ｅ·ｃｏｌｉ中的表达，将完整的ｐｓｂＡ基因正向插入高表达载体ｐＫＫ２２３－３中构建表达克隆ｐＫＴＤ１。含有重组表达质粒的转化细胞经ＩＰＴＧ诱导后提取总蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，小麦叶绿体ｐｓｂＡ基因能在Ｅ·ｃｏｌｉ中表达３２ｋＤ的Ｄ１蛋白，表达的Ｄ１蛋白占细菌总蛋白的３％以上。     

克隆蓝藻Calothrix sp.PCC7601 cpcB2A2基因的初步研究

从蓝藻Ｃａｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．ＰＣＣ７６０１染色体ＤＮＡ中分离出含藻蓝蛋白基因ｃｐｃＢ２Ａ２的略３．８ＫｂＤＮＡ片段，与质粒ｐＵＣ１８重组，构建成一种重组质粒，ｐＰＣ２１８－ＰＣＺ，转化Ｅ．ｃｏｄｉＪＭ１０９，获得了一系列克隆子，经斑点分子杂交和限制性内切核酸酶分析，筛选出了初步认为含有ｃｐｃＢ２Ａ２基因的克隆子。     

反义PARP基因真核表达重组体的构建及其HeLa转化细胞系的建立

利用DNA体外重组技术将PARP基因cDNA部分序列反向克隆到真核表达载体pMAMneo上,构建成重组质粒pMAMneo－C1．4和pMAMneo－C0．3．将重组质粒pMAM－neo－C1．4转染HeLa细胞,经G418筛选,建成细胞系HeLa－C1．4－neo,Southern杂交结果表明,外源PARP基因cDNA部分序列已稳定整合到受体细胞基因组中,该细胞系的建立为研究聚ADP核糖基化作用在细胞内的功能打下了基础．     

Fractalkine基因真核表达质粒的构建及其在小鼠肝癌细胞中的表达

为克隆小鼠趋化因子Fractalkine(．FK)基因，构建真核表达质粒，并在小鼠肝癌细胞中表达，用以进行肿瘤的基因治疗，用RT-PCR法，从小鼠乳腺癌细胞D2F2扩增FK的cDNA，插入pCR2．1 TOPO载体，测序证实后，将其亚克隆至质粒pIRES中构建FK真核表达载体；用脂质体将重组质粒转染小鼠肝癌MM45 T．Li细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，用RT-PCR和免疫化学方法鉴定转染细胞中FK基因的表达．结果表明：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT-PCR和免疫化学方法证明转基因MM45T．Li细胞克隆中存在小鼠FK基因的表达。     

猪带绦虫抗原基因TS76真核表达的研究

将猪囊尾蚴抗原基因TS76亚克隆至VR1020真核表达载体中，用菌浇原位杂交法筛选重组质粒，将其转染Cos7细胞，用Northern Blot鉴定插入片段的mRNA转录，用ELISA检测其表达产物。结果表现：VTS76在真核细胞中能够转录TS76基因；表面产物被兔抗猪囊尾蚴高免血清所识别，在转染真核细胞后24h，即可检测到正确表达的猪囊尾蚴抗原蛋白。     

Ha-ras和Ki-ras癌基因转染和细胞对小鼠细小病毒杀伤敏感性的相关性(英文)

为研究Ha－ras和Ki－ras癌基因转染和细胞对小鼠细小病毒（MVM）杀伤敏感性间的关系，两个细胞株，即Ki－ras癌基因转化细胞株DT和Ha－ras癌基因转化细胞株REF4-3，被用来作为研究材料．体外细胞集落形成率和细胞在裸小鼠体内的成瘤能力测定显示，和对照细胞NIH／3T3相比，REF4－3和DT对MVM的杀伤作用更敏感．同时，DNA杂交和蛋白免疫沉淀实验结果也显示，在REF-3和DT细胞中，无论是MVM的DNA增殖能力还是其NS－1蛋白的表达能力，均较在其对照组NIH／3T3细胞中高很多．FACA测定也显示，在感染MVM30h后，S期细胞的比例在REF4－3和DT细胞中都有增加，而在NIH／3T3细胞中却略微减少．通过PCR方法也可发现，在受到MVM抑制的REF-3肿瘤中仍可检测到MVM的DNA．     

c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。     

人endostatin基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中表达

为探讨转人血管内皮抑制基因（endostatin）在转染细胞中的表达，利用逆转录病毒载体构建人endostatin基因的重组质粒，通过脂质体（lipofectamine）将重组质粒导入包装细胞PA317,制备重组病毒液。用重组病毒液感染NIH3T3细胞，经G418筛选获得转入endostatin基因细胞株NIH3T3-endo。同法制备对照细胞株NIH3T3-pLncx.PCR检测NIH3T3-endo细胞基因组，在扩增产物中一份550bp人endostatin基因特异性片段，对照组为阴性。免疫组化测定示仅NIH3T3-endo细胞中有外源性endostatin蛋白的表达，说明人endostatin基因已被成功导入NIH3T3细胞，并获得稳定表达。     

pEGFP-N3-t-PA真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达

目的利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物（t—PA）基因并构建一种能高效、安全表达t—PA的pEGFP—N3-t—PA真核表达重组质粒,为进一步研制转基因动物奠定基础．方法采用高效Trizol试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总RNA,RT—PCR获得t—PAcDNA,并将真核表达质粒pEGFP—N3和t—PA基因片段分别双酶切,将回收的pEGFP—N3大片段（4．7kb）与t—PA基因片段（1．1kb）重组．对pEGFP—N3-t—PA质粒进行酶切鉴定和基因测序鉴定．脂质体介导pEGFP—N3-t—PA转染成纤维细胞（NIn313）,并用RT—PCR法从mRNA水平检测t—PA的表达情况,用倒置荧光显微镜检测、分析其在NH 3T3细胞中的表达．结果成功地从黑色素瘤细胞中克隆了t—PA基因,并构建了以pEGFP—N3为载体的真核表达质粒载体,并能在真核细胞中表达、分泌t—PA．结论含t—PA基因真核表达质粒构建成功．     

新基因hSSB1逆转录病毒载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

 hSSB1 (Human Single strand DNA binding protein) 是参与细胞DNA损伤应答的一个重要信号分子。根据GenBank 提供的hSSB1基因序列扩增其cDNA序列,插入到pBABE逆转录病毒载体中, 连接后的质粒转化后经过双酶切,PCR扩增及测序来鉴定pBABE-hSSB1阳性克隆。将阳性表达的pBABE-hSSB1和包装质粒转染到HEK293T细胞中,产生病毒液。将包装好的病毒感染细胞并用嘌呤霉素(puromycin)筛选稳定表达hSSB1的细胞株。重组pBABE-hSSB1质粒经双酶切,PCR扩增鉴定及DNA测序分析等方法证实克隆成功。Western blotting检测发现转染重组质粒pBABE-hSSB1的细胞株中hSSB1蛋白的表达水平高于对照组。该研究成功构建了针对hSSB1基因的逆转录病毒载体(pBABE-hSSB1),并得到了稳定高表达hSSB1的细胞株, 为深入研究其功能奠定了基础。     

出芽酵母蛋白激酶TOS3的过量表达及其在热胁迫应答中的作用

出芽酵母SNF1蛋白激酶参与葡萄糖阻遏和细胞胁迫应答.TOS3可通过磷酸化激活SNF1,参与SNF1调控的信号途径.本研究利用PCR方法扩增tos3基因的蛋白质编码序列,克隆到多拷贝表达载体pYES2/NTA上构建真核表达载体,转化酵母细胞并诱导TOS3过量表达.带HIS6标签的重组TOS3蛋白通过免疫印迹得以鉴定.进一步研究了过量表达TOS3对细胞热胁迫耐受性的影响,发现在热胁迫处理条件下,TOS3过量表达可恢复△snf1突变体细胞的生长缺陷,表明TOS3可能通过不依赖SNF1的其他信号途径参与细胞对热胁迫应答的调控.