在铜绿假单胞菌PAO1和PA14中确定基因岛的新方法

基于基因岛的3种显著特点, 建立了一种新的确定基因岛的方法, 能够较为全面地搜寻特定菌株的基因岛. 以此方法在Pseudomonas aeruginosa PA14和Pseudomonas aeruginosa PAO1中共发现了9个基因岛, 在PAO1中发现2个, 在PA14中发现7个, 其中有4个是已经被研究鉴定, 5个是新发现的基因岛. 9个基因岛中, 有6个的插入位点是tRNA基因, 而其余的3个基因岛中有1个正向重复序列同tRNA基因相关, 1个的正向重复序列是在GMP合酶/谷氨酰胺氨基转移酶双功能酶的3′末端, 只有1个的正向重复序列尚不清楚来源. 对5个未被鉴定的基因岛进行内部基因的功能分析, 预测PA14GI-2是同汞离子摄取相关的基因岛, PA14GI-3是同分泌相关的基因岛, PA14GI-6是毒力岛. 而PA14GI-1和PA14GI-5功能尚不清楚. 对PAO1GI-1, PA14GI-5和PA14GI-7中的整合酶进行分析, 预测了各基因岛的酶切位点和结合位点.     

Bt杀虫基因在转基因双价抗虫棉中的整合与遗传稳定性

Bt抗虫棉中Bt杀虫基因的表达与遗传稳定性对抗虫棉的品种培育和商品化生产至关重要，利用转基因双价抗虫棉R3，R4及R5材料基因组DNA，然后采用GFMCryIA基因的PstI酶切片段做探针，进行Southern杂交分析，研究Bt杀虫基因在双抗抗虫棉虫棉所19材料基因中的整合、拷贝数及遗传稳定性，结果表明，转基因抗虫棉和阳性对照经HindⅢ酶切，Southernblot均出现了约4．7kb的杀虫基因阳性带，从而在分子水平上证实了杀虫基因在棉花基因组中的整合及其完整性，利用在杀早基因中只有一个酶切位点的XhoI酶切后，阳性对照出现了预期大小的17．7kb的阳性带，而双价转基因抗虫棉R3，R4及R5材料均出现了分别为约17．7，8．0，5．5和4．7kb的4条阳性带，初步认为，外源Bt杀虫基因在双价抗虫棉中棉所19材料基因组中至少有4个拷贝，这4个拷贝中很可能有一个以上能够稳定遗传和表达，该研究结果为以后的双价抗虫棉品种培育及商品化生产提供了依据。     

基因枪介导质粒共转化整合模式的FISH研究

利用多色荧光原位杂交（Multi-color FISH)，在基因枪介导共转化的转基因水稻中检出了目的基因barnase-psl片段和报告基因pHcintG。在供试两单株的染色体上，这两个外源基因各有2－3个整合位点。多数情况下，barnase-psl片段与pHcintG整合在染色体的同一位置。同时，选株Q13的伸展DNA纤维荧光原位杂交（Fiber FISH)显示，两基因表现为衔接重复，重复间具有短的间隔。结合Southern杂交结果，对基因枪介导共转化可能的整合模式进行了分析。     

SARS相关病毒(BJ01株)的全序列及其比较分析

严重急性呼吸综合征(SARS)是一种新发现的急性传染病. 对一株已确认为SARS病原体的冠状病毒(BJ01)进行了全基因组序列测定, 并与其他已知病毒进行了比较分析. 该病毒基因组全长为29.725 kb, 含11个可读框(ORFs), 由1个稳定区和1个可变区组成, 其中稳定区编码RNA依赖性RNA聚合酶, 包括两个ORFs；可变区含有4个蛋白质编码序列(CDSs), 分别编码病毒的4个结构蛋白(S, E, M, N蛋白). 此外, 可变区还包括5个非典型的预测蛋白(PUPs). 此病毒基因的排列顺序与其他已知的冠状病毒一致. 通过与已知RNA病毒的序列比对, 可以确认该病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae). 与GenBank中已知的5个SARS相关病毒全基因组序列的比较分析显示, 已在30个核苷酸位置上检出序列差异, 总体突变率为0.1%, 其中15个变异位点在编码区, 可能会导致蛋白质的氨基酸改变(异义突变). S蛋白中已发现3处可能引起该蛋白质物化特征变化的变异, 而该蛋白质可能参与病毒与宿主间的免疫反应. 与病毒包膜形成相关的M蛋白中则已发现两处氨基酸变化. 进化分析表明, SARS病毒可能不是来源于人类, 但没有证据证明是人为制造的. 为了阐明SARS相关病毒的病因学以及排除其他可能的SARS病原体的存在, 仍需进行更深入的研究.     

基因组中双重位点特异性重组体系的建立及应用

应用重组ＤＮＡ技术，将ＦＲＴ－ＦＲＴ和ＬｏｘＰ－ＬｏｘＰ两套重组酶特异的识别位点构建在一个名为Ｃ４ＬＦＹ的载体中，并依次在载体中构建了Ｐ因子、果蝇ｙｅｌｌｏｗ基因的两个外显子和一个内含子、顺式作用元件（启动子和增强子）和侧翼区ＤＮＡ，组成了双重位点特异性重组体系。通过转基因技术将该体系整合到果蝇基因组中，再分别与特异的ＦＬＰ和Ｃｒｅ重组酶相互作用后，成功地在基因组同一位点上完成了ＦＬＰ／ＦＲＴ和Ｃ     

锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶

该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.     

海豚基因组中硒蛋白基因的生物信息学预测

硒蛋白中的硒以硒代半胱氨酸(Sec)的形式存在.Sec由传统的终止密码子TGA编码.由于在可读框中难以区分TGA密码子在硒蛋白中的功能,硒蛋白基因的预测非常困难.利用本实验室建立的真核生物硒蛋白基因预测系统,从海豚基因组中识别了包括含2个Sec的2型碘甲腺氨酸脱碘酶(DI2)、具有可变剪切编码区的1型碘甲腺氨酸脱碘酶(DI1)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、硒蛋白P(SelP)等16个硒蛋白,从基因信息的角度探索了海豚中硒蛋白与其特殊生存环境及进化阶段的关系等问题.     

果蝇3个新的小分子非编码RNA的鉴定

通过比较基因组和分子生物学方法分析了果蝇属中5种果蝇全基因组内含子区域的保守序列, 获得了3个新的非编码RNA基因. 其中一个为具有典型的box C/D家族保守元件及结构特征的核仁小分子RNA基因, 其功能序列可介导28S rRNA的C2673位点的核糖甲基化修饰. 另外两个为miRNA基因, 其转录序列可形成典型的miRNA前体茎环结构; 在果蝇发育的4个时期均可表达产生长度为23个核苷酸的成熟RNA分子. 结果还表明, 在长度为100~500 bp区间的黑腹果蝇基因内含子中存在396个多物种保守序列(MCIS), 这些序列除编码小分子RNA外, 还可能与影响基因转录或转录后加工的顺式元件有关.     

人类基因组CpG岛甲基化概况的预测

CpG岛甲基化在细胞的各种生物过程中扮演着重要角色.开发了预测人类基因组CpG岛甲基化状态的计算模型,获得了目前最好的预测性能,并用此模型对人类全基因组的CpG岛甲基化状况进行了预测.根据预测结果,约31%的CpG岛处于甲基化状态,而位于启动子区的CpG岛则倾向于不被甲基化.染色体R带和G带中CpG岛的甲基化水平没有显著差异.基因启动子区内,不易被甲基化的CpG岛中RNA聚合酶的结合强度显著高于易被甲基化的CpG岛,表明包含不易被甲基化的CpG岛的启动子对应的基因具有更高的表达活性.     

植物反转录转座子功能研究进展

反转录转座子(retrotransposon),是一类以RNA为中介,在反转录酶的参与下,进行自我复制并整合到基因组其他位点中的转座元件(transposableelements,TEs).反转录转座子是许多真核生物基因组的主要组成部分,在高等植物如玉米、小麦等作物中含量丰富.这些反转座子的功能及生物学意义一直以来都存在争议,但越来越多研究表明,它们对于邻近基因的表达调控以及整个生物体基因组的进化有着深远的影响.本文主要从反转座子与非编码RNA的联系及其转座过程所产生的基因结构变异、反转座基因等方面,概述了植物中反转座子功能的相关研究进展.     

整合组学数据的代谢网络模型研究进展

基因组规模代谢网络模型(genome-scale metabolic model, GEM)是根据化学计量平衡原理,基于基因-蛋白-反应三者关联,建立包含细胞生长必需的生化反应数学模型.细胞代谢网络存在复杂的调控,通过基因和蛋白表达量及代谢物浓度变化调节代谢反应通量,而这些数据无法直接反映代谢反应的通量. GEM研究面临的一个挑战是如何整合不直接反映代谢通量的数据类型,并将这些调控过程在代谢模型中进行准确的描述.本文综述了将高通量组学数据整合到代谢化学计量模型中的方法,包括根据基因和蛋白的表达判定代谢反应状态、筛选核心代谢反应集、代谢反应通量边界约束、转录调控网络整合和多时间尺度基因动态表达约束等;比较分析了不同算法的优缺点和应用场景;介绍了GEM与多组学数据整合在解析生物代谢特征、分析遗传和环境扰动、筛选癌症治疗潜在药物靶标和抗代谢药物等方面的应用;展望了组学数据和代谢网络模型集成的发展趋势.     

浅谈煤炭资源整合后的国有企业人力资源整合问题

煤炭资源整合是山西省煤炭行业发展壮大的助推器,更是山西省实现重大战略转型的审慎决策.目前,山西省煤炭资源整合工作总体进展健康有序,并已取得阶段性成果,但整合中也出现一些问题,其中最难的就是如何实现人力资源的整合.文章就国有煤炭企业在人力资源整合过程中遇到的问题进行分析,并在此基础上提出了相应的对策.     

扬子鳄的线粒体全基因组与鳄类系统发生

通过酶切、克隆、测序, 结合Long-PCR和Primer Walking法对扬子鳄线粒体DNA基因组进行全序列测定. 结果表明, 扬子鳄线粒体基因组DNA序列全长为16746 bp, 其基因组碱基组成为29.43%A, 24.59%T, 14.86%G, 31.12%C. 与其他大多数脊椎动物相同, 其基因组由13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因及1个非编码的控制区(D-loop)组成. 基因的排列与已测序的鳄类相似. 在全序列分析的基础上, 对12S rRNA基因序列、16S rRNA基因序列、蛋白质编码基因序列及其合并数据用MP法和ML法构建系统发生树, 结果表明扬子鳄与密河鳄的亲缘关系较近, 支持传统观点. 根据ML树的支长数值估计钝吻鳄属发生的时间为74.9 MaBP, 扬子鳄与密河鳄分歧的时间为50.9 MaBP.     

稻属AA型物种叶绿体基因组的适应性进化

稻属AA型物种包含栽培稻和与其最近缘的野生稻物种,是稻属植物中一个重要的类群.为了探究稻属AA型物种叶绿体基因组的适应性进化,以AA型稻属物种中已经公布的6个叶绿体基因组为对象,利用PAML和Selecton对叶绿体基因进行适应性进化的分析.研究发现,4个基因(matK,ccsA,psbB和rpoC2)经历了正选择作用,并对基因的正选择位点进行了定位,初步分析了正选择位点的变异特点,探讨了正选择位点与蛋白质结构保守性的关系.本研究为深入了解稻属的叶绿体基因及其适应性进化提供了重要参考.     

基于ISSR, AFLP分子标记和cyclins基因克隆的异源四倍体鲫鲤进化分析

为了解两性可育、遗传性状稳定的异源四倍体鲫鲤基因组的进化情况, 用ISSR, AFLP分子标记及cyclin A1和B1基因克隆的方法, 从多倍体基因组和单个基因在多倍体形成前后的变化两个角度对上述问题进行了探讨分析. 研究结果表明, 异源四倍体鲫鲤经过连续15代培育, 仍然保持了原始亲本遗传性状的稳定性, 但基因组的遗传相似性及cyclins基因的碱基变异水平都说明异源四倍体鲫鲤具有明显的偏母性遗传特性. ISSR和AFLP分析表明, 在异源四倍体鲫鲤基因组中, 除了新产生的、原始亲本中没有的DNA条带外, 还发生了原始亲本的DNA带纹消失, 而且消失的带纹倾向于父本基因组. cyclins基因序列分析表明, 在异源四倍体鲫鲤不同于原始亲本的核苷酸变异位点中, 由于存在密码子单个碱基的非同义突变导致了异源四倍体鲫鲤新的氨基酸位点的产生. 异源四倍体鲫鲤上述基因组的非加性变化, 可能是应对杂交和多倍化冲击而使其趋于遗传稳定的一种适应性变化.     

查尔酮合酶超家族(chalcone synthase superfamily)基因重复和分化的式样

查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是类黄酮类物质生物合成途径中的关键酶, 对植物的花色素形成以及抗虫和抗病有重要意义. 本文综述了有关查尔酮合酶超家族基因重复和分化式样的研究进展. 有资料显示, CHS基因在不同植物谱系中发生了不同程度的重复和分化, 导致在多数植物基因组中存在具不同表达特性的CHS重复基因, 并在部分植物基因组中出现由CHS基因分化形成的类CHS (CHS-like)基因. 不同学者对该家族基因序列及其表达式样进行比较分析, 揭示了该家族重复基因表达式样的分化在很大程度上受启动子和顺式调节元件的影响, 结果导致重复基因的亚功能化(subfunctionalization); 而发生在CHS活性位点附近的碱基替换则导致重复基因的新功能化(neofunctionalization), 形成不同的类CHS基因, 且多数类CHS基因是在不同植物谱系中由CHS基因多次独立进化形成, 是趋同进化的结果. 探讨CHS超基因家族的进化历史对深入了解基因重复-分化的过程和机制有很大帮助.     

表达血管内皮生长因子受体2胞外全长片段的重组鼠沙门氏菌对小鼠肿瘤的预防作用

研究目的基因在减毒鼠伤寒沙门菌中的稳定表达及以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的口服基因疫苗体内代谢情况, 并探讨重组疫苗菌防治小鼠肿瘤的可行性. 将真核表达载体pcDNA3.1+/VEGFR2_(n1-7)导入鼠减毒伤寒沙门氏菌SL3261中构建口服重组疫苗菌疫苗SL3261-pcDNA3.1+/VEGFR2_(n1-7). 通过PCR扩增检测真核表达载体中真核启动子CMV; 通过透射电子显微镜下检测重组疫苗菌形态和鞭毛结构, 观察连续传代后重组疫苗菌内目的基因能够稳定表达且不影响重组疫苗菌的生长特性. 重组疫苗菌经由灌胃对小鼠进行基因免疫后, 透射电子显微镜下在小鼠的肝、脾、小肠、大肠组织中可检测到减毒沙门氏菌的分布. 2周后用CT-26小鼠结肠腺癌细胞进行攻击, 疫苗组小鼠肿瘤生长明显受抑制, 且生存期远远超过对照组小鼠(P<0.05), 免疫组化显示免疫组小鼠肿瘤组织内CD4⁺及CD8⁺ T细胞浸润. 肿瘤组织超微结构显示疫苗组小鼠肿瘤细胞分化较两对照组为好. 本研究证实外源性目的基因能够在鼠减毒沙门氏菌中长期稳定表达, 且不影响沙门氏菌的生长特性; 并且该重组疫苗菌可将具有治疗性目的基因带入机体并产生抗瘤效应而本身对机体无明显的毒性效应, 为减毒沙门氏菌作为口服基因疫苗的载体及其在体内的分布代谢提供了理论依据, 为肿瘤的预防和治疗提供一条简便、安全、有效的途径.     

真细菌型的细胞分裂位点决定因子CrMinD基因在衣藻中从叶绿体到核的成功转移

MinD蛋白是一种普遍存在的ATP酶, 在真细菌、古细菌以及植物叶绿体的分裂过程中发挥着关键的作用. 在已研究过的4种绿藻(Mesostigma viride, Nephroselmis olivacea, Chlorella vulgaris, Prototheca wicker-hamii)中, MinD基因均由叶绿体基因组编码. 但在拟南芥中, MinD基因由核基因组编码, 其蛋白定位于叶绿体并参与叶绿体分裂的调控, 说明在高等陆生植物中, MinD基因已经转移到核基因组. 然而, 对于在质体进化过程中MinD基因从叶绿体转移至核的机制还不清楚. 我们从单细胞绿藻(Chlamydomonas reinhardtii, 衣藻)中鉴定了一个核编码的MinD同源物CrMinD, 其在野生型大肠杆菌(E. coli)中的过表达会抑制细胞的分裂并导致丝状细胞的形成, 表明植物MinD蛋白在进化上的保守性. CrMinD-egfp在烟草和拟南芥中的瞬时表达确认了CrMinD蛋白在调节叶绿体分裂中的作用. 在已公布的所有陆生植物质体基因组序列中, 没有发现MinD的同源物, 说明MinD基因从质体转移至核这一事件在进化出陆生植物以前就已经发生了.     

基于剪接信号和调节元件序列特征的剪接位点预测方法

结合剪接相关的剪接信号和调节元件的序列特征信息, 发展高效的剪接位点预测方法, 是真核生物基因预测中一个新课题. 运用熵密度分布(EDP)距离方法、权重数组法(WAM)、κ检验等算法建立了剪接位点相关的剪接信号的统计模型, 同时基于无监督自学习的基序检测方法建立了调节元件的统计模型, 在此基础上设计了基于多层次支持向量机(SVM)的剪接位点预测新算法, 实现了真核基因剪接位点的从头(ab initio)预测. 对人类基因组剪接位点数据的大规模测试结果表明, 本研究提出的方法能够有效地预测人类基因组中的剪接位点, 预测水平不仅全面高于传统的基于剪接信号的预测方法GeneSplicer, 而且在总体预测精度上达到并大部分超过基于调节元件信号的预测方法SpliceScan. 对于低GC含量的基因序列, 本文方法的预测精度明显地高于其他两种方法.     

rps12基因在裸子植物中的分子进化式样

叶绿体rps12基因是所有叶绿体基因中最特殊的,由在基因组上相距甚远的两部分组成,含有3个外显子,经反式剪接作用编码核糖体小亚基S12蛋白.探究该基因的分子进化式样有助于理解该基因的进化过程及基因组特征.应用二代测序技术对南洋杉和柏木的叶绿体基因组进行测序;共选取78种裸子植物和2种蕨类植物,在系统发育背景下结合最大似然法,对rps12基因的进化速率、选择压力和适应性进化进行分析.结果显示,外显子3发生独立的碱基插入事件,发生插入的序列受到了更强的负选择作用;外显子2～3位于反向重复区,它们的替换率显著低于外显子1, rps12编码序列受到更强的负选择作用;适应性进化分析没有检测到正选择位点.结果表明,在裸子植物的进化过程中rps12基因结构稳定,并保持着相对较低的进化速率且表现出高度的保守特性;这为反向重复区具有降低的替换率提供了更多的证据,同时也揭示了裸子植物中存在的进化速率异质性现象.