不同湿重诱导对毕赤酵母发酵生产植酸酶的影响

为了提高毕赤酵母工程菌（Mut+）植酸酶的表达量,对毕赤酵母工程菌50 L发酵生产植酸酶的工艺条件进行了研究。结果表明,通过流加葡萄糖提高菌体湿重到300 g/L,随后停止流加,溶氧回升后流加甲醇开始诱导,最终发酵结束时,植酸酶酶活达到21 666 U/mL,比对照提高12.9%,该诱导湿重有利于发酵生产植酸酶。     

重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体代谢参数分析和动力学模型

采用发酵过程参数相关分析理论,分析了毕赤酵母在不同发酵阶段利用不同碳源时的生理代谢参数变化特征。同时,研究了不同比生长速率下重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体补料分批发酵过程,建立蛋白表达阶段的细胞生长非结构模型,结果表明:比生长速率和甲醇浓度符合Monod方程,最大比生长速率(μmax)为0.101h-1,基质的半饱和常数(Ks)为0.252g/L,细胞得率系数YX/S=0.386g/g,细胞维持系数m=0.011g/(g·h)。当比生长速率为0.016h-1时猪胰岛素前体(PIP)最大比形成速率(qp,max)达0.098mg/(g·h)。该模型能较好预测毕赤酵母表达阶段细胞生长和PIP表达的发酵趋势,用其控制发酵过程,目标蛋白PIP产量为优化前的1.5倍,达0.976g/L。     

植酸酶工程菌产酶条件优化研究

为研究影响植酸酶酵母工程菌的产酶因素，利用摇瓶发酵对毕赤酵母工程菌产植酸酶的最佳甲醇诱导量、诱导时间等因素进行实验分析。结果显示，残留甘油、甲醇浓度、诱导培养时间对植酸酶生产具有重要影响，其中甘油残留会使植酸酶分泌时间延迟，1.5% 甲醇具有最佳诱导效果，在第2天酶活可以达到约1 100 U/mL，低浓度甲醇诱导产酶缓慢积累，而高浓度甲醇对菌体产生毒害。该研究为进一步优化植酸酶工程菌高密度发酵工艺奠定了基础。     

发酵抑制物对树干毕赤酵母戊糖发酵的影响

研究了常见发酵抑制物(甲酸、醋酸和乙醇)对树干毕赤酵母(Pichia stipitis)P2生长和发酵木糖的影响.结果表明:树干毕赤酵母P2具有良好的抗发酵抑制物能力.当发酵液中含有4.0 g/L的醋酸时,树干毕赤酵母P2生长和发酵木糖情况良好;当发酵液中含有5.0g/L的甲酸时,树干毕赤酵母P2对木糖的利用率降低,但对酵母生长的影响并不明显;另外,树干毕赤酵母P2耐受乙醇的浓度约为40.0 g/L.     

优选发酵毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵的葡萄酒酿造应用潜力

实验基于主要发酵副产物的生成含量评价优选发酵毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵对葡萄酒质量的影响。采用优选发酵毕赤酵母Z9Y-3和商业酿酒酵母F33设计同时和顺序两种接种方式启动模拟葡萄汁的酒精发酵,以酿酒酵母和发酵毕赤酵母单菌株发酵为对照。琥珀酸和乳酸利用高效液相色谱法测定,甘油采用高碘酸钠氧化法分析,挥发酸采用水蒸气蒸馏法测定。结果显示,优选菌株参与下的发酵没有显著影响酒精发酵的进程,但在发酵过程中发酵毕赤酵母生长速率低于酿酒酵母。与酿酒酵母纯发酵相比,混合发酵提高了甘油的含量,降低了挥发酸的含量,其中顺序接种的发酵过程中酿酒酵母活菌数最高,发酵毕赤酵母存活期最长(7d),发酵过程中甘油累积量最高(2.7g/L),挥发酸含量最低(0.2g/L)。不同发酵处理中,琥珀酸和乳酸含量均呈现先增后降的趋势,但其最终含量变化不显著。综上可得,优选发酵毕赤酵母和酿酒酵母的混合发酵具有应用于葡萄酒酿造的应用潜力。     

重组毕赤酵母植酸酶N-糖基化位点质谱鉴定

为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯化的植酸酶.使用PNGase F或Endo H脱糖基化酶处理植酸酶后,用胰蛋白酶消化脱糖基化产物.通过纳升级高效液相色谱分离胰蛋白酶切产生的肽段混合物.并在联用的串级质谱上进行肽段测序与N-糖基化位点鉴定.结果显示3种植酸酶蛋白的可检测序列覆盖率均在69%以上,且与文献报道不同,均存在糖基化位点修饰不充分的现象.本实验结果证明了高效液相色谱-串级质谱联用法检测植酸酶N-糖基化位点的有效性,并为植酸酶的糖基化研究提供了新的基础.     

毕氏酵母流加发酵过程的比生长速率控制

在已建立的毕氏酵母发酵过程结构模型基础上，进行了甲醇流加阶段恒定比生长速率控制研究。实验结果表明，基于模型的甲醇进料策略可以将细胞比生长速率恒定地控制在设定值；在比生长速率均值相等的情况下，恒定比生长速率进料策略较之恒速进料策略蛋白产量更高。     

pH对L-天冬酰胺酶发酵的影响及其控制

pH对大肠杆菌L-天冬酰胺酶的产生有很大的影响.通过对不同缓冲体系试验和对摇瓶发酵过程pH变化的分析,了解摇瓶发酵过程中pH对L-天冬酰胺酶合成的影响.采用流加磷酸自控L-天冬酰胺酶发酵过程的pH,可延长发酵周期,有效地防止菌体的过早自溶,大大促进L-天冬酰胺酶的合成,较分批发酵提高产酶83%,达到110 u/mL.发酵动力学特性分析表明,该发酵方式L-天冬酰胺酶的合成与菌体生长不相关,控制比生长速率μ为0.15～0.30 h-1,均有利于L-天冬酰胺酶的合成,可使比产酶速率的最大值Qpmax达到3 922 u/(g h).     

流加葡萄糖对L-天冬酰胺酶发酵的影响及其动力学特性

着重讨论了葡萄糖对Ｌ－天冬酰胺酶发酵过程的影响,并对其发酵动力学特性进行了分析。采用自动流加葡萄糖控制发酵ｐＨ的工艺,可使Ｌ－天冬酰胺酶活力达到６４ｕ／ｍｌ,比添加葡萄糖的摇瓶发酵提高了１４６％。流加葡萄糖控制ｐＨ的Ｌ－天冬酰胺酶发酵是生长相关的;维持２～５ｍｇ／ｍｌ和１．２～１．４ｍｇ／ｍｌ的葡萄糖浓度,可分别使比生长速率和比产酶速率达到０．８１／ｈ和１２００ｕ／ｇ．ｈ。     

植酸酶基因在毕赤酵母中表达及表达酶性质研究

PCR扩增无花果曲霉 As3 .3 2 4的植酸酶基因 phy A ,测序分析表明 ,phy A 全长1 5 1 5 bp,其中 1 1 1个核苷酸为内含子序列 ,共编码 467个氨基酸 ,N端的 1 9个氨基酸为信号肽 ,序列中存在 1 0个潜在的 N-糖基化位点 .构建 phy A 的酵母转化载体 p PIC9K/phy A ,电击法转化毕赤酵母 GS1 1 5 ,获得植酸酶基因重组酵母菌 GS1 1 5 /phy A .其发酵酶活性比 As3 .3 2 4提高了 3 3倍 .GS1 1 5 /phy A 植酸酶作用 p H有两个峰值 ,分别为 2 .5和4.5 ,最适作用温度为 60℃ .与 As3 .3 2 4相比 ,重组毕赤酵母 GS1 1 5 /phy A 植酸酶的热稳定性有显著提高 .     

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHCMVp的研究

目的：提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法：将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS—PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果：摇瓶培养时,转化子在体积分数1％的甲醇pH6．0的条件下诱导72h,A600(菌体密度)为45．2,目的蛋白表达量达到10．2mg／L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1％甲醇诱导48h,最终A600(菌体密度)达到124,每升发酵液中含目的蛋白57．21mg。结论：通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。     

解淀粉芽孢杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达。SDS-PAGE试验表明:该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达。植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L。     

重组毕赤酵母发酵甘油制备α-葡聚糖酶的研究

【目的】考察甘油对组成型毕赤酵母（Pichiapastoris ）生长和α-葡聚糖酶表达量的影响。【方法】采用单因素实验法考察初始发酵培养基中甘油浓度、补料阶段甘油残留和通气量等对α-葡聚糖酶表达量的影响。【结果】发酵培养基中初始甘油浓度从50 g／L提高到150 g／L,菌体生长和α-葡聚糖酶表达量均未受到影响,继续提高到200 g／L时,α-葡聚糖酶表达量明显下降。补料过程甘油残留在0～5 g／L,菌体生长和α-葡聚糖酶表达量最佳,当甘油残留较多时,菌体生长和α-葡聚糖酶的表达量均受到影响。提高通气量有利于增加α-葡聚糖酶的表达量,发酵78 h为宜,在此条件下α-葡聚糖酶酶活力达1763 U。【结论】该工艺优化了以甘油作为碳源制备α-葡聚糖酶的发酵条件,提高了α-葡聚糖酶酶活力,为大规模生产α-葡聚糖酶奠定了基础。     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.     

重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

采用Mut^s表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油—甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g／L,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mmol／L时,影响了血管生长抑制素的表达。改变pH调节方式并在发酵后期添加25mmol／L(NH4)2SO4使发酵液中铵离子浓度维持在150mmol／L以上,血管生长抑制素的表达产量达到108mg／L。     

α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达

为避免α-葡聚糖造成的制糖过程中的糖分损失、制炼难度增加以及糖产品质量下降,利用α-葡聚糖酶分解而直接去除α-葡聚糖是目前最佳的选择.文中扩增了α-葡聚糖酶基因dex,构建组成型表达载体pGAPZαA-dex;以毕赤酵母KM71H为受体菌,将表达载体整合进入受体菌基因组,构建了组成型表达α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌.摇瓶发酵120h,α-葡聚糖酶酶活达到60.4U/mL,从而实现了α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达,使发酵过程无需使用甲醇进行诱导,提高了生产和使用安全性.     

真菌嵌合体植酸酶的构建及其抗蛋白酶水解特性研究

 在烟曲霉植酸酶（Afp）的基因上,通过PCR逐步将编码1-47、178-237及338-381多肽序列的DNA片段置换为黑曲霉NRRL 3135植酸酶（Anp）中的对应片段,构建了3个嵌合体（嵌合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）基因,并在毕赤酵母中将其成功表达及纯化。所有的嵌合体和亲本植酸酶均能抵抗胃蛋白酶。在m(胰蛋白酶)/m(植酸酶)为0.1时,Anp完全失活;但Afp与所有嵌合体的活性仅损失13%~23%。胰蛋白酶水解产物的SDS-PAGE结果显示嵌合体Ⅱ与Ⅲ也能被胰蛋白酶严重水解,但非变性PAGE结果却表明它们在水解后仍能保持结构完整。嵌合体也具有一些与Anp及Afp相异的新pH曲线及耐热性。实验表明,通过替换基因片段改良真菌植酸酶可行。