高密度培养基因工程大肠杆菌生产α-乙酰乳酸脱羧酶

在 30 0 0 L 发酵罐中 ,利用分批补料培养技术高密度培养含分泌型重组质粒 p ETGAU- 10的大肠杆菌TG1,生产α-乙酰乳酸脱羧酶。通过控制发酵条件 ,发酵液的细胞密度 (OD60 0 )可达 30 .5 ,且胞外α-乙酰乳酸脱羧酶活力最高达 890 U .ml- 1 ,达到较为理想的工业化生产的要求。     

α-乙酰乳酸的合成及α-乙酰乳酸脱羧酶产生菌的筛选与鉴定

利用有机反应合成α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯，后者经NaOH水解生成的α-乙酰乳酸，可以用作测定α-乙酰乳酸脱羧酶(简称ALDC)活力的底物．通过富集，从土壤和水体中分离出100株产芽孢的菌株，其中获得VP反应为阳性的37株芽孢杆菌，通过对ALDC活力的反复测定，得到7株有较高酶活性的菌株，并根据其生理生化的特征进行了初步的鉴定，为进一步开发和利用α-乙酰乳酸脱羧酶奠定了基础．     

地衣芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶的纯化及酶学性质

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheni formis）AS10106α－乙酰乳酸脱酸酶经硫酸沉淀，聚乙二醇沉淀，DEAE－Sepharose Fast Flow离子交换，Gigapite K-100S柱层及SephadexG－100分子凝胶过滤柱等分离纯化步骤，得到SDS－PAGE电泳纯，α－乙酰乳酸脱羧酶的比活提高了53．5倍。对该酶性质的研究表明，酶单亚基分子量为32Kda，等电点为4．5；该酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH为6．0，对热（40℃以上）敏感。在pH5．0－6．5之间稳定。酶活不需要金属阳离子，Cu^2 、Co^2 强烈抑制酶的活性。摇瓶实验表明，纯化的地衣芽孢杆菌α－乙酰乳酸脱羧酶能明显降低双乙酰的形成并缩短其还原时间。     

地衣芽孢相菌高α—乙酰乳酸脱羧酶活力菌株的筛选

以从土壤中分离出的9株地衣芽孢杆菌为源菌株，通过α-乙酰乳酸脱羧酶活力实验发现BL-4的产酶活性最好，通过UV和NTG对BL-4进行复合诱变，获得了一株产酶活性比出发菌株BL-4高1.22倍的α- 乙酰乳酸脱羧酶高产菌株，并研究了该菌株的最佳发酵产酶条件是培养温度30℃，发酵时间36h，发酵液起始pH6.5。     

一株具木聚糖酶活链霉菌的鉴定及其木聚糖降解酶系分析

分离得到一株具木聚糖酶活性的放线菌菌株pp2，该菌株具有典型链霉菌属的形态学特征．通过对其进行形态学、生理生化特性以及16S rRNA基因序列等方面的分类学研究。菌株pp2初步鉴定为链霉菌属的一个潜在新种，通过对菌株pp2的酶系研究发现该菌株胞外发酵液具木聚糖酶活性，细胞破碎液中具α-L-阿拉伯糖苷酶活性和β-D-本糖苷酶活性．其中木聚糖酶酶活力为30．3U／mg，酶反应最适温度为65℃，最适pH为5．4；37℃下稳定性很好，60℃下酶活性衰减很快、α-L-阿拉伯糖苷酶酶活力为1．81U／mg。酶反应最适温度为55℃，最适pH为6．0，55℃下稳定性能很好．β-D-木糖苷酶酶活力为0．04U／mg．     

地衣芽孢杆菌高α-乙酰乳酸脱羧酶活力菌株的筛选

以从土壤中分离出的9株地衣芽孢杆菌为源菌株,通过α-乙酰乳酸脱羧酶活力实验发现BL-4的产酶活性最好,通过UV和NTG对BL4进行复合诱变,获得了一株产酶活性比出发菌株BL-4高1.22倍的α-乙酰乳酸脱羧酶高产菌株,并研究了该菌株的最佳发酵产酶条件是培养温度30℃、发酵时间36 h、发酵液起始pH 6.5。     

猪心肌乳酸脱氢酶的提纯工艺及酶反应最适条件

研究了适合于工业化生产的猪心肌乳酸脱氢酶的初步提取工艺，经硫酸铵分级沉淀得到酶的比活为86．5U／mg，再经DEAE离子交换层析比活可达525．0U／mg，酶活总收率为54．5％．并对酶促反应的最适条件进行了研究，其最适反应pH为7．6～7．8，最适反应底物浓度分别为NADH5mg／mL和丙酮酸钠25mmol／L。     

ALDC产生菌BD-5菌株的发酵条件初探

本文主要以2#培养基为基础，对BD－5菌株的产酶发酵条件做了初步探讨。通过对其葡萄糖、酵母膏、pH值及金属离子等不同用量的研究使α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活力提高4～5倍。     

固定化真菌α淀粉酶在海参饵料添加剂方面的应用研究

采用海藻酸钠为载体固定化真菌α-淀粉酶,首次作为海参饵料添加剂考察了固定化的最适条件和固定化酶的酶学性质.结果表明:海藻酸钠质量分数2.5%,加酶量15%,CaCl2质量分数2%,固定化时间1.0 h固定化酶活力最高.固定化酶的最适温度范围在55～60℃,最适pH在5.0～5.5之间.固定化酶在添加量为0.16 mg/g(干饵料),酶解时间25～30 min效果最佳.     

α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中的应用研究

论述了α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产发酵过程中的形成机理及应用。实验表明：采用在发酵过程中添加α-乙酰乳酸脱羧酶控制双乙酰含量能收到较为明显的效果。     

固定化乙酰胆碱脂酶的研究

以戊二醛为交联剂,将乙酰胆碱脂酶交联固定到硅胶载体上,研究了影响固定化酶的主要因素．通过酶活力的测定,确定了最佳戊二醛浓度、pH值、固定化时间、酶用量、固定化酶的最适作用温度、pH值、酶的稳定性及其回收率．结果表明：戊二醛浓度为0．5％,pH值为8．0,固定3．0h,酶与载体比例为30mg／g可制备良好的功能化载体．固定化乙酰胆碱脂酶最适作用温度和pH范围分别为40℃和6．0～9．0．重复使用10次固定化酶,回收率约为70％．     

壳聚糖固定化果胶酶的制备及其酶学性质研究

以1％壳聚糖与5％戊二醛交联8h制得交联壳聚糖载体,1g载体固定10mg的果胶酶,载体先与酶液缓慢振荡混合30min后,在固定化体系（pH3．4,4℃）中固定反应12h,该条件下制得的固定化酶强度大韧性好。酶活力回收率高达56．31％;固定化酶的最适温度50℃,最适pH3．4,Km^app值为5．42mg·mL^-1,连续使用7次后,酶活力还保留70．45％以上,具有较好的操作稳定性。     

广西科技成果转让推荐

1．项目名称：α-乙酰乳酸脱羧酶生产。项目内容：1)项目建设的必要性及市场分析。     

含α—乙酰乳酸脱羧酶基因重组酿酒酵母的啤酒发酵

利用Ｅ．ｃｏｌｉ和酿酒酵母的穿梭质粒ｐＹＥＳ２为载体,将寻衣芽孢杆菌α－乙酰乳酸脱羧酶基因导入酿酒醇母中,构建了重组质粒ｐＹＥＡ,实现了α－乙酰乳酸脱羧酶基因在酵母菌中的表达。     

固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的制备

粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶通过共价结合在环氧型载体EupergitC上,通过对酶质量浓度、固定化反应时间、pH 值以及反应温度等条件的考察,确定了最优固定化条件：375mg比活力5000U/g的重组粪产碱杆菌青霉素G酰化酶蛋白对应1g载体,最适pH8.0,反应温度30 ℃.反应120h后制得固定化青霉素G酰化酶活力达到220U/g,固定化酶效率为10.7%.该固定化酶可在含饱和乙酸丁酯磷酸缓冲液中彻底水解青霉素G钾盐.经过15批连续水解反应,固定化酶仍保持95%的活力,展现出良好的稳定性.     

地衣芽孢杆菌A.4041耐高温α-淀粉酶的纯化及性质

地衣芽孢杆菌A.4041（Bacillus，licheniformisA．4041）耐高温α-淀粉酶，经硫铁沉淀和垂直板制备凝胶电泳纯化，得到三种电泳均一的组分，α－Ⅰ，α－Ⅱ和α－Ⅲ．其相对质量分数分别为14.7％，32.2％和52.9％；等电点为5．2，5．4和5．5；相对分子质量为48000，55000和60000．酶作用于可溶性淀粉的米氏常数分别为4.5mg／mL，3．4mg／mL和2．6mg／mL．最适作用温度皆为90℃；最适pH为6.0～6.5；稳定pH范围皆为4～11．5在温度高于70℃，保温30min条件下，三组分的活力开始下降，但α－Ⅱ和α－Ⅲ在100℃，保温30min时仍分别保持15％和20％的残余活力，表明该酶的热稳定性良好．Ca2+，Mg2+，K+对酶明显激活；Cu2+，Fe3+，Zn2+，Al3+，EDTA、甲醛、戊二醛对酶强烈抑制．     

固定化桔青霉发酵核酸酶P1的研究

以玉米芯颗粒吸附桔青霉(Penicillium citrirum)孢子，再用1．5％的海藻酸钠包埋吸附固定化细胞玉米芯颗粒，于摇瓶中进行分批培养。实验结果表明：在固定化细胞产酶的条件下，培养基中淀粉水解糖浓度为9g／L，蛋白胨浓度为1g／L，摇瓶转速为180r／min，产酶发酵周期为50h，发酵液中核酸P1的活力高达503U／ml。双载体固定化细胞经30批次连续重复发酵产酶稳定在较高水平，固定化细胞粒子机械强度高。     

蒙脱石K-10固定糖化酶研究

蒙脱石是一种优良的吸附剂，采用吸附法将其作为固定化糖化酶的载体研究固定化糖化酶的性质，结果表明:每克固定化酶的活力3442U；固定化酶的最适pH值是4.8，比游离酶增加了0.2个单位；固定化酶反应的最适温度是60℃，比游离酶升高了5℃；固定化酶的半衰期为12d；固定化酶的Km=14.3g/L，为游离酶的1.47倍.     

离子注入选育α—乙酰乳酸脱羧酶菌株

采用离子注入技术对一株产α-乙酰乳酸脱羧酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus     

麦芽根中5′-磷酸二酯酶的分离提纯及其固定化

从麦芽根中分离得到了5’-磷酸二酯酶,采用戊二醛为交联剂,将该酶固定到壳聚糖上,用于酵母RNA的催化水解,以制备5’-核苷酸．研究了酶固定化反应的影响因素,在最适条件下,酶活回收率可达53．6％．进一步研究了固定化5’-磷酸二酯酶的酶学性质,测得固定化酶的米氏常数‰为15．38mg／mL（以RNA为底物）,固定化酶催化水解RNA的最适温度75℃,最适pH值为5．5,实验发现固定化5’-磷酸二酯酶具有更好的耐热性和更高的纯度．