复苏植物牛耳草BhLEA2基因启动子的分离和基因表达模式研究

为研究干旱诱导的基因表达模式,利用Inverse-PCR和Tail-PCR的方法从复苏植物牛耳草（Boea hygrometrica（Bunge）R Br．）中扩增出胚胎发育晚期丰富蛋白编码基因BhLEA2的1215bp启动子序列,命名为PBhLEA2。构建了由PBhLEA2启动子引导GUS嵌合基因的植物表达载体pBhLEA2-GUS,并经农杆菌介导导入到烟草中,得到4株转基因烟草植株。GUS检测分析表明,该启动子可驱动GUS报告基因在转基因烟草的种子和刚萌发的小苗的子叶和胚轴中高效表达,在10-20d苗龄的植株中不表达,表现出一定的发育阶段和组织特异性。干旱、高盐胁迫及脱落酸（ABA）、乙烯和H2O2等信号分子可在不同程度上诱导GUS报告基因在20d苗龄的转基因植株的叶片中表达,但只有ABA可诱导其在根中表达,表明该启动子对BhLEA2基因表达的调控受环境信号影响。     

tritordeum花粉特异性表达的遗传分析

为明确转基因tritordeum中被外源uidA基因标记的启动子的调控特异性,对筛选到的一株标记材料进行了两代uidA基因的遗传表达分析,结果表明,后代材料基因组中都含有uidA基因,没有发生分离,且都只在花粉中检测到GUS活性,在其他组织没有检测到GUS活性.进一步RT-PCR分析显示uidA基因在根和叶中没有发生转录,说明该株材料为花粉特异性启动子被uidA基因标记的阳性纯合体,实验证明该特异性能稳定遗传.     

一个水稻花发育特异性启动子的克隆与活性分析

用PCR方法从水稻中克隆了EXPANSIN家族基因OsEXPB1的启动子,利用PLACE软件在线分析其上游2.7kb的序列,发现存在2种与花粉特异性表达有关的顺式作用元件.将该启动子与GUS报告基因融合,构建重组表达载体并转移到水稻中,对水稻各组织进行GUS染色.结果显示:水稻幼嫩组织中均有GUS染色信号;进入生殖生长期后,在营养组织中均没有检测到GUS的表达;只在花器官中检测到GUS信号,在花发育晚期,GUS信号则主要出现在花粉粒中.荧光实时定量PCR进一步验证了GUS染色的结果.综上所述,在水稻成熟植株中,OsEXPB1启动子是一个花发育特异性启动子,可为利用水稻生殖生长期的花特异性表达启动子来进行转基因实验提供备选.     

水稻OsDTH10基因CRISPR/Cas9编辑突变体的创建及功能分析

为了探究OsDTH10基因在水稻生长发育及开花中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsDTH10基因进行定向编辑.在OsDTH10基因的第4个外显子处设计sgRNA的靶位点,通过PCR扩增与Os U6SK空载体连接形成OsU6SK-sg RNA融合载体,再将获得的sg RNA和Cas9连接到植物双元载体pCAMBI1300中,得到重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10.利用农杆菌介导的植物转化法得到转基因植株,对其进行鉴定并测序.本研究共获得3个株系8株转基因植株,测序结果显示,2号株系的4株转基因植株由于发生了单碱基的插入,基因测序出现了套峰.田间表型观察发现,2号株系的4株T0代转基因植株抽穗期早于空载体对照,获得的T1代转基因植株抽穗期比对照的提早8 d.这些结果表明,重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10成功实现了对水稻OsDTH10基因的定向编辑.     

甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因启动子遗传转化烟草的研究

蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase,SPS)是调节甘蔗蔗糖合成的关键酶之一.根据课题组已经构建的甘蔗SPS5侧翼序列驱动GUS表达的载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,转化模式植物烟草,获得26棵抗性植株.抗性植株的PCR结果表明,获得3株转基因植株.GUS染色分析说明,SPS的5侧翼序列可以驱动GUS基因表达,SPS的5侧翼序列具有启动子活性.     

bar基因表达框和完整质粒转化对水稻农艺性状的变异效应比较

通过分析转基因植株的株高、分蘖数、结实率、千粒重四个主要农艺性状的变异,比较基因枪法转化的基因表达框(仅含启动子、基因开放阅读框和终止子序列)和完整质粒两种基因载体形式对水稻农艺性状的变异效应.结果表明,与非转基因亲本相比,转基因植株的千粒重和分蘖数与对照无显著差异;株高变异也不大,17个转基因株系中,仅基因表达框转化的2个株系XFb-36和XFb-63株高变矮;而结实率变异最大,有9个转基因株系结实率显著降低,变异率达50%以上.总体上看,基因表达框和完整质粒两种基因载体形式对水稻农艺性状的变异效应差异不明显,基因枪转化对水稻农艺性状的变异效应主要表现为降低植株的育性,转基因水稻植株的农艺性状变异主要来源于转基因过程中组织培养引起的无性系变异.     

拟南芥器官大小调控基因AtKIX8启动子的克隆和表达分析

为研究拟南芥器官大小调控基因AtKIX8的表达模式,以期进一步研究其功能机制,克隆了该基因启动子序列,获取了启动子-GUS转基因报告植株.利用GUS组织化学染色检测了该启动子作用位置,利用荧光定量PCR分析了启动子对外源激素及冷胁迫的响应.结果表明该启动子诱导GUS基因在幼苗茎尖分生区,成株茎、叶主脉中特异性表达,生长素和低温处理显著提高GUS基因的表达量.说明拟南芥AtKIX8基因启动子具备组织特异性表达模式,且能受到外源生长素和低温的诱导.     

表达雪花莲外源凝集素基因的油菜转基因植株的获得

利用农杆菌素LBA4404（pCAMBIA3300RG)转化优良甘蓝型油菜恢复系W723的下胚轴节段.pCAM-BIA3300RG含有Rssl启动子引导的雪花莲外源凝集素基因（gna）和CaMV-35S启动子引导的除草剂抗性基因（bar）。经过两轮除草剂（2.5mg/L bialaphos）筛选（两周/轮）,除草剂抗性再生芽被传入生根培养基中生根,对根系旺盛生长的植株中所含gna基因进行PCR分析,PCR分析证实了这些植株确为转基因植株,利用Western印迹法对随机选择的5株含gna基因的转基因植株的分析发现,其中4株表达了gna基因。目前正对这些表达gna基因的转基因植株进行后代遗传分离分析。     

一个水稻类受体蛋白激酶OsRPK2的过量表达分析

为了解类受体蛋白激酶Os RPK2在水稻发育中的作用,采用反向遗传学方法构建了该蛋白激酶基因的过表达载体,将其导入野生型水稻中获得转基因植株后,观察植株的表型变化以及该基因在水稻植株不同部位的表达情况.结果发现,Os RPK2的转基因植株产生白化现象,q RT-PCR分析表明白化植株中Os RPK2的表达量明显增加,说明水稻转基因植株的白化表型是由Os RPK2基因的过表达造成的.Os RPK2的组织特异性表达结果表明,Os RPK2在水稻的不同组织器官中均有表达,但在水稻幼嫩的分生组织和幼龄叶片中表达量较高,反映了Os RPK2在水稻植株发育及建成中具有重要作用.     

水稻Rho家族OsRac2启动子的转基因功能鉴定

采用PCR扩增的方法,构建了OsRac2基因转录起始位点上游1.7 kb的启动子5′缺失植物表达载体,转化烟草并筛选阳性转基因植株.以多种激素处理转基因烟草,通过组织化学分析和GUS荧光活性的检测,证实Os-Rac2启动子上存在着一些激素应答元件,该基因的表达可能受茉莉酸的正调控,脱落酸等激素的负调控.     

TaNHX2基因植物表达载体的构建及在烟草中的表达

将TaNHX2基因重组于质粒pBIN438的CaMV 35S启动子下游,构建含TaNHX2基因的植物双元表达载体pBIN438-TaNHX2.采用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tobacum L.),获得含TaNHX2的转基因烟草植株.经PCR、RT-PCR分析表明,TaNHX2基因已整合到烟草中,并且得到表达.耐盐分析表明,外源基因TaNHX2提高了转基因植株的耐盐性.     

大豆外源基因转化体系建立及条件优化研究

建立了适用于多个大豆品种的萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法,对影响农杆菌介导转化的有关参数进行了比较研究。确定的优化条件为:预培养3d,在菌种活化液的OD600值为0.6并加以200μmol.L-1乙酰丁香酮的农杆菌菌种活化液,侵染时间为6h,共培养3d。在优化条件下,将携带GUS基因的35S启动子驱动的表达载体pCAMBIA1304的根癌农杆菌菌株GV3101分别转入鲁豆11和潍6823中,获得510株鲁豆11再生植株和591株潍6823再生植株,其中,抗性再生植株分别为444株和462株。通过PCR和GUS检测,证明分别获得了13株和15株转基因植株,转化率分别为2.2%和2.5%。     

抗除草剂基因atzA在转基因水稻中的遗传

研究了细菌阿特拉津氯水解酶基因atzA在转基因水稻AA269株系自交和回交后代中的遗传规律．结果表明：atzA基因作为一个显性遗传位点遵循孟德尔遗传分离规律．除草剂抗性鉴定结果表明,在T1代水稻群体中除草剂抗性和敏感株数遵循3：1的分离规律,T2代稳定纯合;T2～T7自交世代的转基因植株均保持稳定的除草剂抗性．在BC1～BC3代群体中除草剂抗性和敏感株数遵循1：1的分离规律,BC群体自交的BCF2群体中遵循3：1分离规律．分别对AA269／9311的B3F1和B2F2群体中的一个株系进行了PCR分析,PCR阳性株与阴性株的分离比例分别符合1：1和3：1,与除草剂抗性鉴定结果一致．对T7代群体中部分单株的Southern杂交和RT—PCR分析表明,atzA基因已稳定遗传至T7代,并得到表达．     

水稻OsDDB2基因过量表达载体的构建及其转化

利用农杆菌介导法将构建好的水稻OsDDB2过表达载体导入水稻,共获得植株4株,经PCR检测确定4株皆为转基因植株.田间性状分析发现转基因植株的结实率(平均6.05%)远远低于野生型植株的结实率(平均87.4%).相应地,花粉粒I_2-KI染色结果显示转基因植株的花粉数远少于野生型植株的花粉数.这些初步实验结果为进一步研究水稻DDB2基因的功能奠定了基础.     

苦瓜McAG2启动子的克隆与表达研究

文中从苦瓜基因组中克隆得到长为1417 bp的McAG2基因5′上游片段并进行了DNA序列分析.通过PCR得到了其缺失片段,将其插入pBI121载体替换CaMV35S启动子,得到了McAG2基因5′侧翼缺失表达载体.并利用农杆菌介导转化烟草,建立了相应的转基因烟草植株,以研究其在不同器官组织中的表达特性. β-glucuronidase(GUS)染色结果显示该启动子在转基因烟草叶片和根组织中没有表达活性.     

褐飞虱喂养试验显示表达GNA的转基因水稻纯系抗褐飞虱

利用基因枪法将含有3个不同基因（hpt,gus和gna）的质粒pWRG1515和pRSSGNA1共同转化粳稻品种鄂晚5号成熟胚诱导的愈伤组织。共再生出35株独立转基因植株。PCR／Southern印迹法分析发现,83％的转基因植株含有所有3个外源基因。Western印迹法分析发现79％的含gna基因的转基因植株以不同水平表达GNA。遗传分析证实外源基因在转基因植株后代中以孟德尔方式遗传。从其R1代亲本为孟德尔3：1方式遗传的R2代中,鉴定出2个含有所有3个外源基因的独立转基因植株纯系。这些纯系具有相似的外源基因表达量。褐飞虱喂养试验表明,这些纯系对褐飞虱具有显著的抑制作用。这些褐飞虱抗性提高的转基因纯系将应用于水稻抗虫育种中。实验证明,通过遗传转化和筛选可获得含在农业上有应用价值基因的转基因水稻纯系。     

油葵种子特异性基因HaAP10启动子克隆及功能验证

为研究植物脂质转移蛋白基因HaAP10启动子能否在油葵种子中驱动外源基因特异性表达,从油葵(Helianthus annuus L.)基因组DNA中采用PCR技术克隆了HaAP10基因上游的调控序列964bp.序列分析结果表明,964bp核苷酸序列与报道序列同源性99%,包含TATA-box等基因表达的重要特征元件及种子特异表达所必需的核苷酸序列.将其与β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因融合构建植物表达载体,并利用花粉管通道法转化油葵获得转基因植株,通过PCR鉴定和组织化学染色进行分析.PCR扩增初步证明目的片段已整合到油葵基因组中,组织化学分析表明HaAP10基因启动子能够驱动GUS基因在种子中特异表达,而在根、茎和叶中无GUS活性.结果表明HaAP10基因上游964bp片段可驱动外源基因在油葵种子中特异性表达,具有种子特异性启动子的功能,为油葵植物生物反应器的构建提供了优良的基因资源,同时也为油葵的油脂基因工程改良提供了基因资源.     

通过遗传转化获得含多基因的水稻转基因纯合植株

利用基因枪法将含有4个不同基因的3个质粒共转化由粳稻品种鄂宜105号和鄂晚5号种子胚诱导的愈伤组织（5－10d龄）。从轰击的986块愈合组织中共再生出169株独立的转基因水稻植株（转化率为17％）。PCR／Southern blot分析显示70％以上的转基因植株含有所有4个基因。GUS组织化学分析、Western blot和或RT－PCR分析表明所有4个基因的共表达率为70％。未观察到任何质粒在整合中存在优势,转基因拷贝数也与基因表达量无关。遗传分析证实外源基因在后代植株中大多以孟德尔方式遗传。从其R1代为3：1孟德尔方式遗传的后代R2代植株中,鉴定含有3个或4个不同基因的转基因纯合植株系。PCR／Southern blot分析证实了这些转基因纯合植株系。这些系的植株具有相似的外源基因表达量。我们证实通过基因枪介导的共转化,结合常规育种方法筛选可以获得含多基因的转基因水稻纯合植株。这项技术为利用基因同时改良作用多个性状提供了一种途径。     

非生物胁迫下小麦TaGAPCp1基因启动子的功能分析

探究质体形式的GAPCp (Plastidial glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因启动子响应干旱、盐和外源ABA等非生物胁迫的机理.首先从中国春小麦中克隆得到TaGAPCp1基因上游1 985 bp的核苷酸序列,经Plant CARE数据库分析表明,该启动子含有众多防御和逆境响应元件(defense and stress-responsive ele-ments,DSREs),激素响应元件(hormone-responsive elements,HREs)和光响应元件(light-responsive ele-ments,LREs).从小麦数据库下载Ta GAPCp亚家族基因启动子序列,序列对比分析表明,该亚家族成员启动子上功能元件种类相近但数量相差较大.构建含TaGAPCp1基因启动子的表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草并进行ABA (100μmol·L~(-1))、PEG8000 (20%)、Na Cl (250 mmol·L~(-1))和4℃低温处理,组织化学染色显示TaGAPCp1基因启动子能驱动GUS基因的表达但活性明显低于Ca MV35S,GUS活性分析显示TaGAPCp1基因启动子能响应非生物胁迫.通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,经潮霉素和羧苄青霉素筛选及叶片PCR检测,最终获得稳定遗传的转基因拟南芥20株,并得知转基因拟南芥中的GUS基因能被干旱胁迫显著诱导表达.     

利用RNAi沉默技术对水稻OsHAD1基因的功能分析

生物信息学分析推测了水稻OsHAD1基因属于HAD(haloacid dehalogenase)超级家族水解酶.为研究其功能,本实验设计构建了OsHAD1-RNAi载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻,成功获得了转基因植株.结果表明,转基因植株与野生型(日本晴)相比,转基因植株从T0代到T2代结实率均有20%～50%的降低;实时荧光定量PCR分析显示,T2代独立转基因植株中OsHAD1基因的表达量均有50%以上的下调;花粉染色结果显示,转基因植株花粉染色异常,败育率高,平均败育率达71.19%;石蜡切片结果显示,转基因植株花粉形状不规则,在花粉囊中排列松散,并且植株表现出明显的雄性不育.因此,推测OsHAD1基因参与水稻的生殖发育.