中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化

采用正交设计法,从dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量4个因素3个水平出发,优化设计圆尾鲎DNA的PCR反应体系(引物为中国鲎微卫星引物).并采用直观分析方法分析正交试验结果,最终建立了圆尾鲎SSR-PCR最佳反应体系:总体积20μL,Taq DNA聚合酶1.5 U、dNTPs 0.16 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L;并通过PCR梯度实验进一步优化模板DNA质量浓度、退火温度及退火时间,获得最佳反应条件:模板DNA质量浓度为30 ng/μL,退火温度为48℃,退火时间为20～25 s.对最佳反应体系和反应条件进行了检验,结果显示该反应体系稳定性高、重复性好.     

真藓(Bryum argenteum)ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了确定真藓最佳ISSR-PCR反应体系,采用PCR正交实验设计方法,对影响ISSR-PCR试验的模板DNA、引物、d NTPs、Mg2+、和Taq DNA聚合酶5个因素在4个水平上进行优化,并对100条引物逐一进行温度梯度PCR,筛选合适的引物并确定每个引物的最佳退火温度.结果显示优化的20μL ISSR-PCR反应体系中包括20 ng/20μL DNA模板、0.45μmol/L引物、2.65 mmol/L Mg~(2+)、0.4 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.45 mmol/Ld NTPs.利用该体系最终筛选出50条扩增条带清晰,重复性好,多态性高的引物并确定其退火温度.这一体系的建立、引物的筛选及退火温度的确立为进一步利用ISSR分子标记技术对苔藓遗传多样性的研究提供理论基础.     

地石榴ISSR扩增体系优化及应用

以地石榴为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子,如引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、模板DNA浓度、退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合地石榴的IS-SR-PCR反应体系:20μL体系中,10×buffer 2.0μL,引物0.50μmol.L-1,dNTPs 0.15 mmol.L-1,Mg2+1.2mmol.L-1,Taq DNA酶1.25 U,模板DNA 25 ng.确定了适宜的退火温度为52℃.利用该优化后的体系从60条ISSR引物中筛选出了12条,随机选取2条对10份分布于不同地区的地石榴标本基因组DNA进行扩增,证实了该体系稳定可靠,可用于进一步分析地石榴居群遗传多样性.     

藜ISSR-PCR反应体系的优化

采用TaKaRa的PCR反应系统,以从藜(Chenopodium album L)幼叶中提取纯化后的总DNA为模板,进行UBC 859号引物的ISSR-PCR扩增实验,分别测试了镁离子、模板DNA和Taq DNA聚合酶含量对反应结果的影响,通过各因子的浓度梯度组合实验,确定了在25 mL体积的PCR反应中:酶配套缓冲液2.5μL,dNTPs0.2μmmol/L,引物0.2 mmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,模板含量为40 ng,Taq DNA聚合酶为1.5 U是藜最佳的ISSR-PCR反应体系。     

极小种群喙核桃ISSR-PCR反应条件的建立与优化

本文采用正交和单因素相结合的方法研究dNTPs、Mg²⁺、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、循环次数及退火温度对喙核桃ISSR-PCR扩增效果的影响,以期为喙核桃遗传多样性评价、亲缘关系分析等研究奠定基础。结果表明：喙核桃最佳ISSR-PCR扩增体系及程序为20 μL的反应体系含dNTPs 0.5 mmol/L、Mg²⁺ 3.0 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 45 ng、10×PCR Buffer 2.0 μL。退火温度为54.4℃,循环次数为40。本研究建立的喙核桃ISSR-PCR反应体系稳定、可靠,可用于该物种遗传多样性分析。     

黑老虎ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立和优化特色药食两用植物黑老虎（Kadsura coccinea）的ISSR-PCR反应体系和扩增程序,通过正交和单因素试验研究Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数等因素对黑老虎ISSR-PCR反应体系扩增效果的影响。结果表明,在20 μL的反应体系中,最佳扩增条件为Mg²⁺浓度2.5 mmol/L、dNTPs浓度0.1 mmol/L、引物浓度0.6 μmol/L、Taq DNA聚合酶用量1.50 U、模板DNA用量45 ng,退火温度50.4℃,循环40次。这一优化体系的建立可为深入开展黑老虎种质资源遗传多样性研究奠定基础。     

沙棘属植物RAPD-PCR反应条件的优化

采用L16(45)正交试验设计研究了沙棘属植物RAPDPCR反应中DNA模板浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2 浓度和Taq酶含量等5个因素对于PCR扩增效果的影响,并对照温度梯度探讨了退火温度等热循环参数,确定适合沙棘属植物的最佳扩增体系为:模板DNA1.0mg·L-1,引物3.0μmol·L-1,dNTPs0.1mmol·L-1,Mg2 2.5mmol·L-1,Taq聚合酶8.33～16.67nkat;扩增程序中最适退火温度为35～36℃.     

海南普通野生稻ISSR-PCR反应体系的优化

通过不同浓度的Mg2+、模板DNA、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度和循环次数的单因素试验,筛选海南普通野生稻最佳ISSR-PCR反应体系为:15μl反应体系中含2.0 mmol/L MgCl2,50 ng模板DNA,200μmol/L dNTPs,1.20 U Taq酶,1.5μmol/L ISSR引物,50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3).反应程序:94℃预变性5 min;94℃,1 min,52℃,1 min,72℃,2 min,35个循环;72℃延伸10min,4℃保存.     

东方百合ISSR-PCR反应体系的正交优化

以东方百合‘Constanta’和‘Sorbonne’以及9份‘Constanta’בSorbonne’的F1代为试材,采用改良的CTAB法提取百合嫩叶DNA,利用正交设计L16(45)对东方百合ISSR-PCR反应体系的Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物5种因素在4个水平上进行优化试验,采用直观分析结合方差分析评价扩增结果。最终获得的最佳反应体系为:在20μL反应体系中,含Taq DNA聚合酶0.5μmol/min、Mg2+1.75 mmol/mL、模板DNA 40～100 ng、dNTPs 0.15 mmol/mL、引物0.6μmol/L、10×PCR Buffer 2μL,不足部分以ddH2O补足。在获得最佳反应体系的基础上采用单因素实验确定了引物最佳退火温度范围为55～45℃,最佳循环次数为30次以及延伸时间为1.5 min。应用该优化的反应体系,对‘Constanta’和‘Sorbonne’以及9份‘Constanta’בSor-bonne’的F1代DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化的反应体系具有较高的扩增稳定性。     

唇鱼骨基因组DNA提取与ISSR-PCR的优化

以唇鱼骨为材料,分别采用4种不同方法(CTAB法、SDS法、ROSE法及试剂盒)提取基因组DNA,并对影响PCR反应的模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+、Taq酶浓度等主要因子进行了优化,建立了适合唇鱼骨基因组DNA的ISSR-PCR反应体系.25μL的PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:约60 ng模板DNA,1.2 U Taq酶,0.4 μrnol/L引物,2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,2%甲酰胺.结果表明,利用优化反应体系对4种不同方法提取的DNA进行PCR扩增,均能得到较好的PCR扩增条带,以试剂盒法最佳,为淡水溪流性同属鱼类遗传多样性分析奠定了技术基础.     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立

以油茶品种大别山2号和赣兴46为试验材料,利用Me5Em8正反向引物组合进行了SRAP-PCR反应体系的L9(34)正交试验,采用正交设计直观分析及方差分析对影响SRAP反应的Taq聚合酶、Mg2+、dNTP和引物浓度进行分析,并对模板DNA浓度进行了单因素试验分析。结果表明,油茶SRAP-PCR 20 μL反应体系的最佳组合为: Taq聚合酶1.20 μmol/min、Mg2+浓度125 mmol/L、dNTP浓度0.15 mmol/L、Primer浓度0.60 μmol/L、模板DNA含量60 ng,并含有2 μL 10×buffer(Mg2+ free)。各因素对油茶SRAP-PCR反应的影响大小依次为:dNTP、 Mg2+ 、Taq聚合酶、Primer。     

贵州山核桃ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立贵州山核桃ISSR-PCR最佳反应体系,采用单因素试验的方法,对影响ISSR-PCR反应体系的模板DNA浓度、MgCl2浓度、d NTPs浓度、Taq酶用量、引物浓度等各因素进行了研究,确立了贵州山核桃ISSR-PCR的最佳反应体系。结果显示:最优反应体系的模板DNA浓度为40ng/u L、引物浓度为0.3umol/L、Mg2+的浓度2.9mmol/L、酶浓度0.3U、d NTPs浓度0.2mmol/L,退火温度为54℃。建立该反应体系可为贵州山核桃ISSR标记开发、物种分类鉴定、遗传图谱构建等后续分析奠定基础。     

利用正交设计优化一品红SRAP反应体系

运用L16（4^5）正交设计对影响一品红SRAP反应的5个因素（DNA模板浓度、M矿’浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶）在4个水平上进行优化试验,PCR结果采用DPSV3．01软件分析。结果表明,各因素对SRAP反应的影响依次为：Mg2＋〉引物〉dNTPs〉DNA模板〉Taq酶;一品红SRAP反应最佳体系为：50μL的PCR体系中含有Mg2＋ 2．5mmol·L-1．引物500pmol·L-IdNTPs 0．20mmol·L-1．DNA模板100ng、Taq酶1．0U;应用最佳反应体系对PCR程序中的退火温度进行优化,得出SRAP—PCR反应适宜的第一步退火温度为36℃,第二步退火温度为50℃。     

西瓜种植物RAPD分析影响因子的研究

以西瓜种内的１２个品种（系）为模板ＤＮＡ,研究了影响ＲＡＰＤ扩增效果的因素。结果表明,模板ＤＮＡ、Ｔａｑ酶、随机引物、Ｍｇ２＋浓度以及ＰＣＲ反应程序在ＲＡＰＤ分析中都具有重要的作用。根据以上因子的研究结果,建立了适合西瓜种植物的ＲＡＰＤ分析的技术体系：１０μＬ反应液中,模板１０ｎｇ／１０μＬ,引物０５μｍｏｌ／Ｌ,ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８３）５０ｍｍｏｌ／Ｌ,ＢＳＡ５００μｇ／ｍＬ,ＭｇＣｌ２２５ｍｍｏｌ／Ｌ,ＴａｑＤＮＡ０６Ｕ／１０μＬ,ｄＮＴＰｓ２００μｍｏｌ／Ｌ,１０％蔗糖４００和１ｍｍｏｌ／Ｌ甲酚红。     

阔叶十大功劳ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用单因子试验和正交设计方法,对影响阔叶十大功劳ISSR-PCR反应体系的引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA及退火温度5个因素进行优化,为探讨阔叶十大功劳种质遗传多样性奠定基础.结果表明:阔叶十大功劳ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20μL反应体系中,0.5μmol/L引物、0.5UTaq酶、150μmol/L dNTPs和20ng模板DNA.在最佳反应条件下,从80条引物中筛选出15条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并经过9份阔叶十大功劳种质检验,证明该体系具有扩增条带清晰、稳定、重复性好等优点.综上所述,本文所建立的ISSR-PCR反应体系可用于阔叶十大功劳的种质鉴定及遗传多样性分析.     

用正交设计优化甜菜RAPD反应体系

采用正交设计对甜菜的RAPD反应体系进行优化．应用L25（5^6）正交表,研究了Taq、Mg^2＋、随机引物、dNTPs和DNA模板5种RAPD反应组分浓度变化对扩增结果的影响,并进行量化分析,试验结果表明用这种方法建立的甜菜RAPD-PCR优化反应体系为：25μL反应体系中含1×Buffer、1．0mmol／L Mg^2＋、1U TaqDNA聚合酶、0．25mmol／L dNTPs、0．4μmol／L随机引物及25ng DNA模板．     

仁用杏SRAP-PCR体系的正交设计优化

改良CTAB法提取仁用杏基因组DNA,用于建立SRAP-PCR体系。采用L16（44）正交设计试验,对影响仁用杏SRAP-PCR反应体系的4因素（dNTPs浓度、Mg^2＋浓度、引物浓度、Taq聚合酶量）4水平进行筛选,PCR结果经统计软件SPSS V13.0分析,并对退火温度进行了摸索,确立了仁用杏SRAP-PCR的优化体系：总体积为20 L,dNTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg^2＋浓度为2.5mmol/L,引物浓度为0.9μmol/L,Taq聚合酶量为1.5 U,退火温度为52℃。本优化体系为仁用杏资源遗传分析奠定了技术基础。     

山药基因组DNA的提取和RAPD反应条件的优化

研究了山药基因组DNA的提取方法;对Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优化,建立了最佳的RAPD反应体系:在25μL反应体系中Mg2+浓度为2.0 mmol.L-1,dNTPs浓度为0.25 mmol.L-1,引物浓度为20 pmol.L-1,Taq酶1.5 U,模板DNA为200 ng.扩增程序为:95℃预变性7 min;94℃变性30 s,36℃退火45 s,72℃延伸2 min,共35个循环;72℃终延伸10 min.     

欧洲甜樱桃RAPD反应体系的建立与优化

以欧洲甜樱桃萨米托品种为研究对象,利用改进的CTAB法提取基因组DNA,并通过单因素多水平梯度试验,筛选了模板、Mg2＋、TaqE、dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立了欧洲甜樱桃RAPD技术扩增体系．研究结果表明,在25出反应体系中,各组分最佳的浓度分别为：10×Buffer2．5μl,2．5mmol·L^-1Mg2＋2．5μl,Taq E0．06U·μl^-1,0．2mmol·L^-1dNTPs,0．2μmol·L^-1Primer,模板DNAl．2ng·μl^-1．PCR循环程序为：94℃预变性4min。94℃变性40s,36℃退火45s,72℃延伸1min,共36个循环,最后72℃延伸7min．