NAC1启动子驱动GFP表达的组织特征及对生长素和赤霉素的反应

将拟南芥中转录因子基因NAC1上游调控区1kb克隆到pRD420质粒，构建由NAC1启动子驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）表达的植物表达载体，并以此载体转化烟草，对阳性转基因植株研究表明，GFP在根部有较高水平的表达.进一步用生长素、生长素拮抗剂NPA和赤霉素处理，荧光强度的变化表明：该调控区受生长素作用的同时也受赤霉素诱导.初步说明NAC1基因不仅是一个生长素反应基因，同时可能也是一个赤霉素反应基因.     

棉花GhGAI1基因克隆及其功能的初步分析

DELLA蛋白是赤霉素信号通路中重要的蛋白质作用因子,负调节植物体中赤霉素的水平,同时受到生长素、脱落酸和乙烯的共同调节。根据已知的生物信息数据,本研究克隆了棉花GhGAl1基因,序列分析表明它编码DELLA蛋白。构建GFP与GhGAl1融合蛋白重组质粒,利用根癌农杆菌介导的花浸泡转基因方法转化拟南芥columbia生态型植株,进行过量表达实验。结果表明,GFP—GhGAl1融合蛋白定位于细胞核并且在施加赤霉素后迅速降解,表明该基因编码蛋白参与赤霉素信号通路。     

组蛋白去乙酰化抑制剂对拟南芥根尖干细胞微环境的影响

根系发育是植物生长的重要组成部分,该过程由多种信号转导途径共同调节。组蛋白乙酰化和去乙酰化的动态变化对基因表达具有关键的调控作用,而对其在根发育中功能的研究还不深入。本研究通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A（TSA）处理拟南芥,发现其主根生长受到抑制,分生区细胞数目变少。显微观察的结果表明TSA影响了根尖干细胞微环境。根尖微环境调控相关因子SCR和SHR的表达受TSA处理的影响并不明显,而PLT1/PLT2的表达受TSA强烈抑制。我们对生长素运输途径的分析发现在TSA处理条件下,PIN1表达只受轻微影响,而PIN2表达量明显下调。pDR5:GFP的结果表明TSA可能引起生长素在根尖的积累和分布变化。综上所述,TSA影响了拟南芥根尖干细胞微环境的维持,表明组蛋白的去乙酰化在根发育过程中发挥着重要作用。     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达及调控

采用酵母杂合启动子PADH2－CUP1或PADH2－GAPDH及终止子TADH1，构建了一系列酵母表达载体．在这些表达载体中插入乙肝病毒表面抗原S－preS1融合基因SA－28后，将合乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒PHC11的BamHI位点．然后将表达质粒分别转化酿酒酵母Y16，Y19．对SA－28基因表达的研究表明，在酵母菌胞内实现了SA－28基因的高表达，且表达受葡萄糖浓度调控．     

用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠

以慢病毒（lentivirus）载体为骨架，携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的假病毒，通过小鼠受精卵卵周隙注射，将其感染小鼠受精卵，经移植于假孕母鼠后获得转基因小鼠．应用PCR、荧光显微镜观察和流式细胞仪分析等技术，证明了GFP基因的整合率达到40%以上；实时定量PCR分析结果表明转基因小鼠中GFP基因整合的拷贝数约为40；染色体荧光原位杂交分析结果显示GFP基因在小鼠染色体上的整合是随机的，并通过交配可将外源基因遗传至子代，获得的多整合位点和不同表达水平的转基因小鼠具有明显的实际应用和研究价值．文中报道的慢病毒载体介导的转基因技术为高效制备和选育高表达转基因小鼠品系提供了一种有效的途径．     

苦瓜(Momordica Charantia L.) MADS-box基因BAG启动子的克隆分析及表达载体的构建

作者提取苦瓜基因组总DNA，构建了DNA步移文库，并根据已克隆并公布的苦瓜MADS-box基因BAG的基因序列设计引物，通过染色体步移技术克隆出BAG基因起始密码子上游调控序列BAGP．对BAGP的鉴定和分析表明其具备大多数高等植物启动子的保守元件，预测它对BAG基因的表达具有一定的作用．为鉴定BAG基因的基本启动子元件。将基因5′侧翼序列做缺失片段分析，利用PCR方法从BAGP中得到3个大小不等两端带有HindⅢ,BamHⅠ酶切位点的片段BAGPl，BAGP2和BAGP3，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP)中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报告基因GFP的植物表达裁体BAGPVl，BAGPV2和BAGPV3．     

红系特异表达载体在转基因小鼠中表达的研究

为在个体水平上研究珠蛋白基因位点控制区的HS2,HS3及HS2-HS3元件对β-珠蛋白基因的时空表达调控作用,选择本实验室构建的CMV/GFP,HS2ALL,HS3ALL,HS23ALL等4种重组载体,经限制性酶切及两步纯化,得到了5种重组DNA片段:CMV/GFP,HS2/GFP,CMV/HS2/GFP,HS23/GFP,HS3/GFP,并用显微注射技术获得转基因小鼠.用流式细胞仪分析转基因各组织中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,结果表明HS2元件及1.7kb的β-珠蛋白启动子足以调控β-珠蛋白基因的组织特异性表达.此外,在不同的转基因小鼠中,GFP的表达虽有明显的个体差异,但综合分析比较可以看出,HS2与HS3元件在调控β-珠蛋白基因表达方面,其增强子作用基本相当,且两者显示出显著的协同作用.     

大豆降解组文库microRNAs的启动子分析

研究目的：创新要点：通过分析miRNA的核心启动子和顺式作用元件为进一步解析大豆（Glycinemax）miRNAs表达调控及其功能研究提供重要信息。利用生物信息学方法全面解析了大豆降解组文库miRNA的启动子特征,并依据顺式作用元件及靶基因构建了miRNA的表达与生长素响应因子、赤霉素响应因子之问存在潜在的负反馈调控网络。研究方法：本研究利用TSSP程序和PlantCARE数据库预测了来自大豆降解组文库的440个miRNA的核心启动子以及369个miRNAs的顺式作用元件,并依据顺式作用元件及靶基因构建miRNA调控网络。重要结论：83．86％的miRNA在其上游序列中含有启动子,8．64％的miRNA在其下游序列中含有启动子,21．59％的miRNA包含增强子。核心启动子的TATA盒与转录起始位点（TSSs）的分布相似（见图2）。此外,对转录起始位点5’端的顺式作用元件预测为miRNAs的可能功能和表达的时空性提供了线索。miRNAs的顺式作用元件和靶基因的分析显示,部分miRNA的表达与生长素响应因子、赤霉素响应因子之间存在潜在的负反馈调控（见图3）。     

腺病毒载体介导GFP基因在鸭胚和雏鸭体内的表达

本试验旨在探讨腺病毒在鸭胚和雏鸭体内的感染情况,为腺病毒作为外源基因载体在活体上进行RNA干涉奠定基础．将GFP基因重组腺病毒（Adv-GFP）静脉注射15日龄鸭胚和10日龄雏鸭,在感染后不同时间采集组织器官,制作冰冻切片,荧光显微镜观察GFP基因在鸭胚和雏鸭组织器官中的表达．结果发现,GFP基因在Adv．GFP感染后24-72h能在鸭胚肝脏及心肌细胞中表达,在感染后1-5d,GFP基因可在雏鸭肝脏、脾脏、腔上囊中稳定表达．本试验首次证明腺病毒作为安全的外源载体,可介导外源基因在鸭胚和雏鸭体内的靶器官中持续稳定表达,为在鸭上进行病毒病的基因治疗提供了基础数据．     

棉花腈水解酶基因GhNIT响应非生物胁迫和激素的表达分析

腈水解酶是植物中调控生长素合成色胺(Tryptamine,TAM)途径的关键酶,在生长素的合成及进一步调控植物发育和逆境胁迫响应过程中发挥着重要作用。为了认识腈水解酶在植物生长发育中的功能,本研究在前期获得棉花腈水解酶基因GhNIT的基础上,分析了该基因参与棉花纤维发育的表达特征及组织特异性特征,结果表明:Gh NIT基因在棉花开花后16 d和25 d的纤维组织中及花器官(花瓣和花药)中具有较高的表达。克隆获得该基因1500 bp的启动子序列并进行了顺式作用元件分析,pGhNIT启动子包含典型的核心元件TATA框和CAAT框,此外,还包含TC-rich repeats、MBS等元件,尤其是包含许多响应非生物胁迫和激素的元件如热激、干旱和氧化等胁迫响应元件以及赤霉素(Gibberellic acid,GA)和光响应元件,如Box-4、Box-1、G-box等。pGhNIT启动子元件组成分析结果暗示该基因的表达可能受非生物胁迫和植物激素的诱导。进一步以棉花幼蕾为材料进行干旱、高温、低温、黑暗、氧化胁迫等逆境处理,及赤霉素和生长素处理,分析Gh NIT基因的表达特征,结果表明:GhNIT在4℃处理3 h后被显著诱导表达,且其在黑暗处理16 h再恢复光照后表达量增加;此外,Gh NIT的表达显著受高温、聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)和H2O2诱导;在GA处理2 h和吲哚-3-乙酸(Indole-3-cetic cid,IAA)处理1 h后,GhNIT的表达显著上调。本研究结果可为深入研究腈水解酶参与棉纤维发育及调控植物生长发育的重要功能提供良好参考。     

茉莉酸对水稻根系生长素合成及运输的调控

以水稻中花11和DR5∷GUS转基因植株为实验材料,观察茉莉酸(Jasmonic acid,JA)对水稻根系中生长素积累和分布的影响.结果表明,JA负调控水稻主根、冠根和侧根的生长,抑制DR5∷GUS在水稻根系形态学下端的表达.实时定量PCR结果显示,在JA处理的水稻根系中,7个水稻生长素合成基因OsYUCCAs(OsYUCCA1～7)全部显著下调表达,4个生长素输入载体基因OsAUX1,OsAUX3～5显著上调表达,4个生长素输出载体基因OsPIN1b、OsPIN1c、OsPIN2、OsPIN9显著下调表达.     

文昌鱼Pax1/9基因上游调控区的克隆及分析

脊椎动物Pax1/9是一重要的发育调控基因亚家族,文昌鱼基因组中仅有单一的该亚家族直系同源基因Amphi-Pax1/9,为检验此基因上游调控元件的功能在脊椎动物体内是否具有通用性,将文昌鱼Pax1/9基因上游约4.6 kb的侧翼序列与绿色荧光蛋白(GFP)报告基因连接,构建重组质粒表达载体(pAmphiPax1/9-AcGFP),显微注射斑马鱼胚胎,并以斑马鱼Pax1和Pax9的上游同源序列为阳性对照.结果表明,阳性对照斑马鱼胚胎中GFP能够表达,但注射pAm-phiPax1/9-AcGFP质粒的斑马鱼胚胎中无明显的GFP表达,这一现象可能是由于Pax1/9上游调控序列在二物种间存在较大的进化差异,启动元件具有物种特异性.     

Elafin重组腺病毒载体在气道上皮细胞中表达的时相性变化研究

为研究elafin重组腺病毒表达载体Ad～elafin转染气道上皮细胞的特性，探讨其在上皮细胞中表达的时相性变化，运用①应用原代培养技术培养人气道上皮细胞；②Ad—elafin表达载体转染气道上皮细胞；③在转染后不同的时相中，采用荧光显微镜观察报告基因GFP的表达，ELISA法单克隆抗体检测细胞上清液elafin蛋白的表达，Northern膜杂交检测elafin基因mRNA的表达量等方法进行研究．发现：①原代培养人气道上皮细胞约5d即可作为靶细胞。②转染Ad—elafin24h时，荧光显微镜下可见上皮细胞内有少量的GFP表达，随着时间的延长，细胞内荧光逐渐增加，96h时GFP荧光阳性的细胞约为80％。③转染24～96h，实验组细胞上清液elafin的含量高于对照组（p〈0．01）；同时elafinmRNA的水平高于对照组（P〈0．05，0．01），且elafin表达及elafinmRNA水平在一定时间内呈时间依赖性关系。结论：Elafin重组腺病毒表达载体Ad—elafin成功转染人气道上皮细胞，目的基因不仅能在上皮细胞中表达，而且elafin蛋白具有细胞外分泌作用．     

携带p53基因重组腺病毒载体的构建

将pCMVp53重组转移载体经BamHI和NheI酶切,得到p53基因cDNA,然后将cDNA片段克隆到转移载体pCMV5GFP,使其受CMV5启动子的调控,获得pCMV5p53重组转移载体.用该线状重组转移载体与腺病毒右臂DNA经磷酸钙共转染293细胞获得重组腺病毒,经酶联免疫吸附法(ELISA)测定p53蛋白含量,证明外源p53基因在含重组腺病毒的293细胞中得到表达.     

β—半乳糖苷酶基因在小鼠乳腺细胞表达的研究

构建了以乳清酸蛋白（ＷＡＰ）５′区２．６ｋｂ为调控序列,指导β－半乳糖苷酶基因的真核表达质粒,采用直接注射质粒于乳腺的方法在小鼠乳腺中表达出β－半乳糖苷酶活性,证实ＷＡＰ基因调控序列的功能正确性,可以用于转基因动物乳腺表达研究,同时证实该方法可以作为一种暂时性表达载体的验证方法．     

基于雌激素受体的全人源基因表达调控系统的构建与优化

目前基因治疗已经成为精准医疗体系中重要组成部分。然而,靶标基因在体内表达量的不可控给基因治疗的安全性带来一定风险。本研究在雌激素受体诱导系统的基础上,优化构建了全人源基因调控系统,并通过绿色荧光(Green fluorescent protein,GFP)或荧光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)跟踪诱导系统的活性。当使用外源诱导药物4-羟基他莫昔芬和内源诱导药物17β-雌二醇进行诱导时,前者可以高效诱导GFP和Gluc在HEK293细胞中的表达,并且表达强度与剂量呈正相关。通过水高压将载体注入小鼠体内,进行药物诱导后发现,4-羟基他莫昔芬更高效的诱导报告基因GFP的表达。成年小鼠尾静脉注射1×10~(13)vg/kg的AAV2/8-pZFHD1-hER-GFP病毒实验结果显示,第一次给药后,能够明显观察到GFP在肝脏组织的表达,但是药物在小鼠体内被代谢后,GFP的表达消失;当再次给药后,GFP荧光又重新被诱导。综上所述,本研究构建的人源化雌激素受体介导的调控系统在体内外均可调控目的基因的表达及开关。     

腺病毒载体介导GFP基因在鸭胚和雏鸭体内的表达

本试验旨在探讨腺病毒在鸭胚和雏鸭体内的感染情况,为腺病毒作为外源基因载体在活体上进行RNA干涉奠定基础．将GFP基因重组腺病毒（Adv-GFP）静脉注射15日龄鸭胚和10日龄雏鸭,在感染后不N时间采集组织器官,制作冰冻切片,荧光显微镜观察GFP基因在鸭胚和雏鸭组织器官中的表达,结果发现,GFP基因在Adv-GFP感染后24-72h能在鸭胚肝脏及心肌细胞中表达,在感染后1-5d,GFP基因可在雏鸭肝脏、脾脏、腔上囊中稳定表达,本试验首次证明腺病毒作为安全的外源载体,可介导外源基因在鸭胚和雏鸭体内的靶器官中持续稳定表达,为在鸭上进行病毒病的基因治疗提供了基础数据．     

GA合成酶GA3OX1参与拟南芥避荫反应

避荫反应是避荫植物针对光这一环境信号做出的可塑性反应,对其适应环境胁迫和生存具有极其重要的意义.本研究以拟南芥避荫突变体sav8为材料,通过对其表型鉴定,发现sav8在模拟遮荫后下胚轴较短,其成年植株矮小、分枝较多、顶端优势不明显;在模拟遮荫条件下的激素处理实验中,sav8对赤霉素(GA)表现出超敏感.通过图位克隆,我们确定了sav8是在赤霉素合成基因GA3OX1序列上第1 358位碱基由C突变为T,引起编码蛋白第309位谷氨酰胺的密码子变为终止子.进一步研究表明,遮荫处理诱导赤霉素合成基因GA3OX1表达上调,并且此上调不依赖于色氨酸氨基转移酶基因TAA1.结果说明GA3OX1是避荫反应途径中赤霉素合成调控的关键基因.     

植物根尖分生组织干细胞调控模式

静止中心(QC)形成和干细胞区特化是植物根尖分生组织确立的标志。静止中心位于根尖分生组织中心,干细胞围绕在静止中心细胞周围。依赖于生长素的PLT途径和不依赖于生长素的SCR/SHR途径共同发挥维持静止中心细胞稳定的作用。静止中心和干细胞区的柱干细胞之间存在类似于WUS/CLV3的WOX5/ACR4/CLE40的反馈抑制调节途径,该调节途径维持着静止中心细胞和柱干细胞之间的平衡。静止中心和其他类型干细胞之间也可能存在类似的反馈抑制调节途径。生长素、细胞分裂素、赤霉素等植物激素信号在根干细胞功能发挥方面也起到重要作用,与各种基因一起组成根分生组织干细胞调控网络。     

菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体构建及原核表达

分析菠菜叶绿体基因组全序列,选用了rbcL基因和accD基因的间隔区作为外源基因的定点整合位点,并从菠菜叶绿体基因组中克隆了rbcL基因全长和accD基因的5′端部分,长度分别为1956 bp和1320 bp。以这2个DNA片段作为同源重组片段,以烟草叶绿体基因的启动子Prrn和终止子psbA3′控制外源基因的转录,构建了包含筛选标记基因aadA基因(编码氨基糖苷-3′-腺苷酸转移酶,具有壮观霉素和链霉素抗性)和报告基因GFP(编码绿色荧光蛋白)的菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGA。酶切结果显示构建正确。将该载体转化大肠杆菌,在激光扫描共聚焦显微镜下用488 nm蓝光激发,发现大肠杆菌发出强烈的绿色荧光,而对照菌体没有荧光,表明GFP基因在原核大肠杆菌中已经成功表达。实验结果说明构建的菠菜叶绿体定点整合表达载体pRAGA可以用于菠菜叶绿体转化。