NACl启动子驱动GFP表达的组织特征及对生长素和赤霉素的反应

将拟南芥中转录因子基因NACl上游调控区1kb克隆到pRD420质粒，构建由NACl启动子驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）表达的植物表达载体，并以此载体转化烟草，对阳性转基因植株研究表明，GFP在根部有较高水平的表达．进一步用生长素、生长素拮抗剂NPA和赤霉素处理，荧光强度的变化表明：该调控区受生长素作用的同时也受赤霉素诱导．初步说明NACl基因不仅是一个生长素反应基因，同时可能也是一个赤霉素反应基因．     

棉花GhGAI1基因克隆及其功能的初步分析

DELLA蛋白是赤霉素信号通路中重要的蛋白质作用因子,负调节植物体中赤霉素的水平,同时受到生长素、脱落酸和乙烯的共同调节。根据已知的生物信息数据,本研究克隆了棉花GhGAl1基因,序列分析表明它编码DELLA蛋白。构建GFP与GhGAl1融合蛋白重组质粒,利用根癌农杆菌介导的花浸泡转基因方法转化拟南芥columbia生态型植株,进行过量表达实验。结果表明,GFP—GhGAl1融合蛋白定位于细胞核并且在施加赤霉素后迅速降解,表明该基因编码蛋白参与赤霉素信号通路。     

茉莉酸对水稻根系生长素合成及运输的调控

以水稻中花11和DR5∷GUS转基因植株为实验材料,观察茉莉酸(Jasmonic acid,JA)对水稻根系中生长素积累和分布的影响.结果表明,JA负调控水稻主根、冠根和侧根的生长,抑制DR5∷GUS在水稻根系形态学下端的表达.实时定量PCR结果显示,在JA处理的水稻根系中,7个水稻生长素合成基因OsYUCCAs(OsYUCCA1～7)全部显著下调表达,4个生长素输入载体基因OsAUX1,OsAUX3～5显著上调表达,4个生长素输出载体基因OsPIN1b、OsPIN1c、OsPIN2、OsPIN9显著下调表达.     

文昌鱼Pax1/9基因上游调控区的克隆及分析

脊椎动物Pax1/9是一重要的发育调控基因亚家族,文昌鱼基因组中仅有单一的该亚家族直系同源基因Amphi-Pax1/9,为检验此基因上游调控元件的功能在脊椎动物体内是否具有通用性,将文昌鱼Pax1/9基因上游约4.6 kb的侧翼序列与绿色荧光蛋白(GFP)报告基因连接,构建重组质粒表达载体(pAmphiPax1/9-AcGFP),显微注射斑马鱼胚胎,并以斑马鱼Pax1和Pax9的上游同源序列为阳性对照.结果表明,阳性对照斑马鱼胚胎中GFP能够表达,但注射pAm-phiPax1/9-AcGFP质粒的斑马鱼胚胎中无明显的GFP表达,这一现象可能是由于Pax1/9上游调控序列在二物种间存在较大的进化差异,启动元件具有物种特异性.     

组蛋白去乙酰化抑制剂对拟南芥根尖干细胞微环境的影响

根系发育是植物生长的重要组成部分,该过程由多种信号转导途径共同调节。组蛋白乙酰化和去乙酰化的动态变化对基因表达具有关键的调控作用,而对其在根发育中功能的研究还不深入。本研究通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A（TSA）处理拟南芥,发现其主根生长受到抑制,分生区细胞数目变少。显微观察的结果表明TSA影响了根尖干细胞微环境。根尖微环境调控相关因子SCR和SHR的表达受TSA处理的影响并不明显,而PLT1/PLT2的表达受TSA强烈抑制。我们对生长素运输途径的分析发现在TSA处理条件下,PIN1表达只受轻微影响,而PIN2表达量明显下调。pDR5:GFP的结果表明TSA可能引起生长素在根尖的积累和分布变化。综上所述,TSA影响了拟南芥根尖干细胞微环境的维持,表明组蛋白的去乙酰化在根发育过程中发挥着重要作用。     

GA合成酶GA3OX1参与拟南芥避荫反应

避荫反应是避荫植物针对光这一环境信号做出的可塑性反应,对其适应环境胁迫和生存具有极其重要的意义.本研究以拟南芥避荫突变体sav8为材料,通过对其表型鉴定,发现sav8在模拟遮荫后下胚轴较短,其成年植株矮小、分枝较多、顶端优势不明显;在模拟遮荫条件下的激素处理实验中,sav8对赤霉素(GA)表现出超敏感.通过图位克隆,我们确定了sav8是在赤霉素合成基因GA3OX1序列上第1 358位碱基由C突变为T,引起编码蛋白第309位谷氨酰胺的密码子变为终止子.进一步研究表明,遮荫处理诱导赤霉素合成基因GA3OX1表达上调,并且此上调不依赖于色氨酸氨基转移酶基因TAA1.结果说明GA3OX1是避荫反应途径中赤霉素合成调控的关键基因.     

红系特异表达载体在转基因小鼠中表达的研究

为在个体水平上研究珠蛋白基因位点控制区的HS2,HS3及HS2-HS3元件对β-珠蛋白基因的时空表达调控作用,选择本实验室构建的CMV/GFP,HS2ALL,HS3ALL,HS23ALL等4种重组载体,经限制性酶切及两步纯化,得到了5种重组DNA片段:CMV/GFP,HS2/GFP,CMV/HS2/GFP,HS23/GFP,HS3/GFP,并用显微注射技术获得转基因小鼠.用流式细胞仪分析转基因各组织中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,结果表明HS2元件及1.7kb的β-珠蛋白启动子足以调控β-珠蛋白基因的组织特异性表达.此外,在不同的转基因小鼠中,GFP的表达虽有明显的个体差异,但综合分析比较可以看出,HS2与HS3元件在调控β-珠蛋白基因表达方面,其增强子作用基本相当,且两者显示出显著的协同作用.     

棉花腈水解酶基因GhNIT响应非生物胁迫和激素的表达分析

腈水解酶是植物中调控生长素合成色胺(Tryptamine,TAM)途径的关键酶,在生长素的合成及进一步调控植物发育和逆境胁迫响应过程中发挥着重要作用。为了认识腈水解酶在植物生长发育中的功能,本研究在前期获得棉花腈水解酶基因GhNIT的基础上,分析了该基因参与棉花纤维发育的表达特征及组织特异性特征,结果表明:Gh NIT基因在棉花开花后16 d和25 d的纤维组织中及花器官(花瓣和花药)中具有较高的表达。克隆获得该基因1500 bp的启动子序列并进行了顺式作用元件分析,pGhNIT启动子包含典型的核心元件TATA框和CAAT框,此外,还包含TC-rich repeats、MBS等元件,尤其是包含许多响应非生物胁迫和激素的元件如热激、干旱和氧化等胁迫响应元件以及赤霉素(Gibberellic acid,GA)和光响应元件,如Box-4、Box-1、G-box等。pGhNIT启动子元件组成分析结果暗示该基因的表达可能受非生物胁迫和植物激素的诱导。进一步以棉花幼蕾为材料进行干旱、高温、低温、黑暗、氧化胁迫等逆境处理,及赤霉素和生长素处理,分析Gh NIT基因的表达特征,结果表明:GhNIT在4℃处理3 h后被显著诱导表达,且其在黑暗处理16 h再恢复光照后表达量增加;此外,Gh NIT的表达显著受高温、聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)和H2O2诱导;在GA处理2 h和吲哚-3-乙酸(Indole-3-cetic cid,IAA)处理1 h后,GhNIT的表达显著上调。本研究结果可为深入研究腈水解酶参与棉纤维发育及调控植物生长发育的重要功能提供良好参考。     

携带p53基因重组腺病毒载体的构建

将pCMVp53重组转移载体经BamHI和NheI酶切,得到p53基因cDNA,然后将cDNA片段克隆到转移载体pCMV5GFP,使其受CMV5启动子的调控,获得pCMV5p53重组转移载体.用该线状重组转移载体与腺病毒右臂DNA经磷酸钙共转染293细胞获得重组腺病毒,经酶联免疫吸附法(ELISA)测定p53蛋白含量,证明外源p53基因在含重组腺病毒的293细胞中得到表达.     

OsNAC2转录因子介导生长素代谢通路调节水稻早期根的发育

NAC家族是植物特有的一类转录因子,在植物的生长发育和逆境胁迫等方面具有重要的功能.研究发现,OsNAC2基因的过表达(ON11)和RNAi(RNAi31)转基因株系,早期主根的长度有显著变化的特征.与野生型日本晴水稻(WT)相比,ON11植株的主根变短,而RNAi31的主根变长.通过对早期OsNAC2pro∶∶GUS株系根尖染色结果表明OsNAC2在根尖具有时序性表达.不同激素诱导OsNAC2表达谱和OsNAC2pro∶∶GUS株系对激素响应结果显示OsNAC2受生长素显著性诱导.结合芯片数据和qRT-PCR分析,OsNAC2转基因株系中生长素合成代谢及信号通路相关基因表达量变化较为明显.同时,ON11根尖淀粉粒发育及其向重力性受到抑制.因此,推测OsNAC2可能通过抑制生长素的合成代谢及信号通路相关基因的表达,降低生长素含量,并参与生长素响应通路,最终影响水稻根的生长.     

过氧化氢对拟南芥生长素信号转导相关蛋白的影响

通过添加外源过氧化氢来探究其对植物生长素信号的影响.以GUS基因作为报告基因,研究拟南芥中各生长素相关蛋白(生长素含量标志蛋白DR5、输入蛋白AUX1、输出蛋白PIN1和PIN2)对过氧化氢的响应.结果表明过氧化氢处理后拟南芥呈植株变小、根变短和不定根数目增多的表型;与对照相比,GUS染色后各生长素相关蛋白的表达下降,表明过氧化氢对植物生长素的合成与运输起一定的抑制作用.在过氧化氢处理的基础上,添加抗氧化物质后发现植株表型有明显恢复,GUS染色也表明相关蛋白的表达量均增加;另外,0.1 nmol/L的外源IAA能恢复过氧化氢处理后拟南芥的表型和生长素相关蛋白的表达.综上所述,过氧化氢主要通过抑制植物体内的生长素信号来调控植物的生长发育.     

禽类多瘤病毒APV-1晚期基因多顺反子的EGFP标记载体构建和表达

为研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的机制,设计和构建了以增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因替代病毒APV-1野生型的晚期结构蛋白VPs基因的真核双顺反子表达载体,并观察其在转染进入禽类原代成纤维细胞中的表达翻译状态.以APV-1的c DNA克隆(p HL1003)为模板,运用PCR技术扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期Agno-1a区序列作为载体片段;从质粒p EGFP-N1中扩增出编码绿色荧光的EGFP DNA片段;经连接构成重组质粒p HL1003-GFP,通过脂质体细胞转染方法将质粒DNA转染到鸡胚胎和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,通过细胞培养观察荧光表达状况.DNA序列分析证实了重组克隆中的EGFP序列与已知的质粒p EGFP-N1中EGFP序列一致.转染72 h后观察鸡和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光,说明GFP可以在构建的双顺反子重组质粒的下游中正常表达并产生荧光.p HL1003-GFP重组质粒的构建及其在禽类原代成纤维细胞中的高效表达,为我们研究多顺反子翻译起始调控中Agno-1a基因的表达对下游病毒结构蛋白基因的翻译调控机制提供了简洁易用的系统和模型.     

过氧化氢对拟南芥生长素信号转导相关蛋白的影响

通过添加外源过氧化氢来探究其对植物生长素信号的影响.以GUS基因作为报告基因,研究拟南芥中各生长素相关蛋白(生长素含量标志蛋白DRS,输入蛋白AUX1,输出蛋白PIN1和PIN2)对过氧化氢的响应结果表明过氧化氢处理后拟南芥呈植株变小、根变短和不定根数目增多的表型;与对照相比,GUS染色后各生长素相关蛋白的表达下降,表明过氧化氢对植物生长素的合成与运输起一定的抑制作用在过氧化氢处理的墓础上,添加抗氧化物质后发现植株表型有明显恢复,GUS染色也表明相关蛋白的表达量均增加;另外,0.1 nmol/L的外源IAA能恢复过氧化氢处理后拟南芥的表型和生长素相关蛋白的表达综上所述,过氧化氢主要通过抑制植物体内的生长素信号来调控植物的生长发育.     

基于雌激素受体的全人源基因表达调控系统的构建与优化

目前基因治疗已经成为精准医疗体系中重要组成部分。然而,靶标基因在体内表达量的不可控给基因治疗的安全性带来一定风险。本研究在雌激素受体诱导系统的基础上,优化构建了全人源基因调控系统,并通过绿色荧光(Green fluorescent protein,GFP)或荧光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)跟踪诱导系统的活性。当使用外源诱导药物4-羟基他莫昔芬和内源诱导药物17β-雌二醇进行诱导时,前者可以高效诱导GFP和Gluc在HEK293细胞中的表达,并且表达强度与剂量呈正相关。通过水高压将载体注入小鼠体内,进行药物诱导后发现,4-羟基他莫昔芬更高效的诱导报告基因GFP的表达。成年小鼠尾静脉注射1×10~(13)vg/kg的AAV2/8-pZFHD1-hER-GFP病毒实验结果显示,第一次给药后,能够明显观察到GFP在肝脏组织的表达,但是药物在小鼠体内被代谢后,GFP的表达消失;当再次给药后,GFP荧光又重新被诱导。综上所述,本研究构建的人源化雌激素受体介导的调控系统在体内外均可调控目的基因的表达及开关。     

拟南芥ACOS5基因表达模式分析

探讨了拟南芥ACOS5基因的表达模式.采用PCR方法对拟南芥col生态型基因组进行扩增,获得ACOS5基因启动子序列,将其连入p1300植物表达载体中以GFP作为报告基因,并将该载体通过农杆菌转基因转入拟南芥col生态型中,观察转基因植物花药中GFP的表达情况.结果:ACOS5::GFP转基因植物从花药发育第四期到十二期均有GFP表达,GFP的表达峰值在第八期.结论:该表达载体可用,且ACOS5基因从花药发育第四期开始有微弱表达,且随着时期发展逐渐增强,至第八期达到表达最高峰值,随后随时期发展表达量逐渐减弱.     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达及调控

采用酵母杂合启动子PADH2－CUP1或PADH2－GAPDH及终止子TADH1，构建了一系列酵母表达载体．在这些表达载体中插入乙肝病毒表面抗原S－preS1融合基因SA－28后，将合乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒PHC11的BamHI位点．然后将表达质粒分别转化酿酒酵母Y16，Y19．对SA－28基因表达的研究表明，在酵母菌胞内实现了SA－28基因的高表达，且表达受葡萄糖浓度调控．     

拟南芥器官大小调控基因AtKIX8启动子的克隆和表达分析

为研究拟南芥器官大小调控基因AtKIX8的表达模式,以期进一步研究其功能机制,克隆了该基因启动子序列,获取了启动子-GUS转基因报告植株.利用GUS组织化学染色检测了该启动子作用位置,利用荧光定量PCR分析了启动子对外源激素及冷胁迫的响应.结果表明该启动子诱导GUS基因在幼苗茎尖分生区,成株茎、叶主脉中特异性表达,生长素和低温处理显著提高GUS基因的表达量.说明拟南芥AtKIX8基因启动子具备组织特异性表达模式,且能受到外源生长素和低温的诱导.     

红锥根系响应石墨烯的转录组学研究

为了研究石墨烯对植物根系响应的分子机制和转录组学，本文以0、25、33和50 mg/L共4组质量浓度的石墨烯溶液培育红锥（Castanopsis hystrix Miq.）幼苗，其中石墨烯溶液质量浓度为0指以蒸馏水培育，并对红锥幼苗的根系发育情况、基因表达量的变化、差异表达基因的富集通路和范围进行了分析。与0相比，25 mg/L石墨烯溶液对红锥幼苗根系发育的促进效果最佳（t=2.86～7.80,P<0.05）；转录组数据表明，25 mg/L石墨烯溶液处理红锥根系后，导致12 845个基因的表达量发生差异，其中石墨烯诱导10 899个基因表达量上调，抑制1 946个基因的表达量。通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集性分析表明：表达量上调的基因主要富集于126个KEGG通路，表达量下调的基因富集于99个KEGG通路；另外，110个转录因子基因差异表达，可归类于33个不同家族，其中ERF、WRKY、MYB、NAC、bHLH、TCP和Trihelix共7个家族基因与红锥根系发育有关；9种植物激素信号转导通路相关的差异表达基因结果表明生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯、水杨酸、油...     

XCRK基因在水稻与细菌性条斑病菌互作中的功能解析

XCRK(Xoc-associated receptor-like kinase)基因是对水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)致病菌侵染应答的差异蛋白质组学研究中发现的一个拟抗病基因.生物信息学分析显示该基因位于水稻的1号染色体上,编码一个含有322个氨基酸的蛋白激酶.组织表达分析显示XCRK基因在根、茎、叶、花序等组织中均有表达,且其表达受高盐、H2O2和脱落酸(ABA)的诱导.为了探究XCRK基因在水稻BLS中的作用,通过PCR扩增XCRK基因编码区,构建超量表达载体,并转化水稻愈伤组织获得了超量表达XCRK基因的转基因水稻植株;同时构建了RNA干扰(RNAi)表达载体,并获得了抑制表达XCRK基因的转基因水稻植株.对T1代转基因植株进行了BLS抗性分析,结果显示:超量表达XCRK基因明显增强了转基因水稻对BLS致病菌的抗性;相反地,抑制表达XCRK基因的转基因水稻对BLS致病菌的敏感性则略有增强.综上结果表明XCRK基因正调控水稻对BLS的抗性,这为进一步研究该基因的作用机制提供了理论依据.     

RNA干扰沉默PID1基因在C2C12细胞中表达的研究

 构建和筛选对PID1（phosphotyrosine interaction domain containing 1, PID1）基因有RNA干扰作用的PID1-shRNA表达载体。据小鼠PID1 cDNA序列,优化设计了4条shRNA及1条阴性干扰序列,插入pGPU6/GFP/Neo载体中,得到pGPU6/GFP/Neo-PID1-1、pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3、pGPU6/GFP/Neo PID1 4和pGPU6/GFP/Neo-PID1-NC。干扰载体转染C2C12细胞,以RT-PCR和Western blot技术检测shRNA对C2C12细胞中PID1 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果表明：靶向PID1基因的4个shRNA重组质粒载体经测序分析,其shRNA编码序列与预期设计的完全一致,经酶切鉴定和测序分析证实,靶向PID1基因的shRNA重组质粒载体构建成功。进一步将构建的4个表达载体分别转染C2C12细胞,24h后细胞中PID1基因mRNA表达水平依次下调 (23.58±1.87)%、(75.44±0.77)%、(70.52±0.41)% 和 (56.60±3.13)%。48 h后细胞中PID1蛋白表达水平依次降低 (30.15±5.05)%、(71.86±4.85)%、(67.93±2.28)% 和 (56.81±2.01)%。所筛选出的pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3和pGPU6/GFP/Neo-PID1-4三个表达载体均能高效地抑制转染细胞PID1 mRNA和蛋白的表达,为进一步研究PID1基因的功能奠定了基础。