α-淀粉酶Amy7C及其突变体最适pH值的定量预测

【目的】pH值是影响酶催化效率的关键参数,通常需要通过实验方式才能确定生物酶的最适 pH 值,而该方式要消耗较多的人力、物力和时间。因此,有必要发展一种利用酶的简单结构信息即可预测其最适 pH 值的方法。【方法】以20-1前馈反向传播的神经网络为模型,完成535种氨基酸属性对α-淀粉酶 pH 值的拟合。同时,将α-淀粉酶 Amy7C及其54个突变体的数据分为2组,用35个酶作为训练组进行拟合,20个酶作为验证组进行检验,并对不同层次及神经元个数的模型进行比较。【结果】109个氨基酸属性可实现20-1神经网络模型收敛,表明这些氨基酸属性可用干预测α-淀粉酶的最适 pH值,但是不同氨基酸属性预测 pH 值的效果差别较大,只有部分指标预测 pH值的效果较好。多模型的分析结果显示,不同模型对训练组R值的结果具有显著性差异,而对训练组P值、验证组R值和验证组P 值结果无显著性差异。【结论】氨基酸分布概率等属性可用干预测α-淀粉酶的最适 pH值。20-1神经网络模型是预测α-淀粉酶最适 pH值相对理想的模型。     

定量预测α-淀粉酶及其突变体的酶反应米氏常数

【目的】α-淀粉酶是一种重要淀粉水解酶，而Km值是酶反应中重要的参数，尝试建立一种利用α-淀粉酶初级结构定量预测米氏常数Km值的有效模型。【方法】通过神经网络模型，利用535种氨基酸属性定量预测α-淀粉酶 Amy7C及其52个突变体反应的Km值，其中33个酶用于模型训练，其余的用于模型验证。首先用双层的20-1前馈反向传播的神经网络进行预测，然后对多层神经网络模型进行筛选。【结果】535种氨基酸属性中有109种属性可以用模型预测，其中动态属性拟合结果较好，4个动态氨基酸属性中有3个属性可以用于模型预测，但拟合结果最好的氨基酸属性分别来自氨基酸理化性质和二级结构。对9种拟合和验证结果最好的氨基酸属性进行7种多层神经网络模型拟合，结果显示增加模型的复杂度并不能提高预测结果的精准度，表明较为简单的模型，如20-1或20-5-1是定量预测建模的首选。【结论】α-淀粉酶酶解反应的米氏常数Km ，可以利用某些氨基酸属性通过神经网络模型进行定量预测。为今后利用酶的初级结构定量预测酶反应中各参数最适条件提供思路。     

大肠杆菌嗜盐α-淀粉酶基因的分子改造及其酶学特性

【目的】对大肠杆菌Escherichia coli嗜盐α-淀粉酶基因进行改造,并探索嗜盐α-淀粉酶的嗜盐特性。【方法】从非嗜盐的大肠杆菌JM109中克隆到一个嗜盐α-淀粉酶基因k6并进行重组表达。通过同源建模,确定Na+结合位点上的氨基酸残基,并对相应位点进行定点突变。最后对突变酶的酶学性质进行研究。【结果】相对于野生酶,突变酶更加嗜盐,其最适NaCl浓度由2mol/L增加到3mol/L,最适pH值为7,最适温度为50℃,酶活力为4 831U/mg,提高近4倍。经HPLC检测,突变酶与2%(W/V)可溶性淀粉反应后的产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的混合物。【结论】嗜盐α-淀粉酶基因k6的嗜盐特性与Na+结合位点具有直接联系。     

田菁根瘤菌嗜盐α-淀粉酶的基因克隆表达与分子改造

【目的】克隆表达田菁根瘤菌嗜盐α-淀粉酶基因,并对其进行基因改造,为探索与嗜盐性相关的氨基酸位点提供参考。【方法】从田菁根瘤菌及周围土壤的宏基因组中克隆到一个命名为RSA的极端嗜盐淀粉酶。通过与同源性为75.33%的嗜盐α-淀粉酶K6的序列比对发现,RSA-D205位点与已报道的K6-N204(嗜盐相关的氨基酸位点)相似,从而对其进行定点饱和突变以研究相关酶学性质。【结果】共获得17个突变子,其最适NaCl浓度较RSA均有不同程度的降低。RSA-D205R、RSA-D205C酶反应温度高达80℃,拓宽了其应用范围。【结论】RSA-D205氨基酸残基位点与Na~+结合位点有一定的联系;另外,精氨酸(R)、半胱氨酸(C)对淀粉酶的高温改造具有参考价值。     

耐热α-淀粉酶的筛选、基因克隆和酶学性质分析

【目的】筛选耐热α-淀粉酶并实现异源表达,同时分析其酶学性质特征。【方法】以M9培养基加上可溶性淀粉作为选择性分离培养基,从腾冲火山温泉土壤中筛选到产淀粉酶的菌株Anoxybacillus sp.GXS-3。根据淀粉酶氨基酸保守序列,设计引物进行PCR扩增,然后对目标序列进行步移扩增,获得淀粉酶基因AmyGX。将AmyGX与表达载体pQE30连接,导入大肠杆菌M15中表达,对重组酶进行分离纯化和酶学性质分析。【结果】AmyGX基因长1 515 bp,编码505个氨基酸残基,前23个氨基酸残基为信号肽序列;重组质粒pQE30-AmyGX编码的蛋白分子量为58.04kDa,对可溶性淀粉催化水解反应的最适温度为60℃,最适pH值为8.0,V_(max)、K_m值分别为0.19U/mg、3.14mg/mL,热半失活温度T_(50)~(30)值为65.2℃;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(3+)、Ba~(2+)对该酶具有明显的抑制作用,Na~+、K~+对该酶有激活作用,Mg~(2+)、Ca~(2+)的影响则不明显。【结论】AmyGX是一种中等耐温碱性酶,在造纸、洗涤剂生产和有毒废弃物去除等方面具有潜在的应用前景。     

贝塔一葡萄糖苷酶催化反应的最适pH值和最适温度的同时预测

利用氨基酸特征同时预测贝塔一葡萄糖苷酶反应的最适pH值和最适温度.首先,用不同的氨基酸特征对贝塔一葡萄糖苷酶进行量化作为输入,以最适pH值和最适温度作为输出;然后用20-2前馈反向传播的神经网络进行训练;最后用子集验证、刀切验证和交叉验证三种方法进行验证.结果表明,在24个氨基酸特征中只有4个特征可以用于模型预测,其中...     

SUMO融合表达对淀粉酶N-Amy活性的影响

前期解析了一个来自嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的新型的碱性淀粉酶Amy703,该酶含有一个未知功能的N端结构域,将该结构域缺失后得到的突变体N-Amy相对野生型Amy703比酶活提高了35倍;底物结合实验显示Amy703可以结合不可溶性底物,单独的N端结构域和N端结构域缺失突变体N-Amy都不能结合,推测N端结构域会造成催化结构域的结构变化从而引起比酶活的大幅提高.为了进一步探究Amy703特异的N端结构域造成酶活显著下降的原因,将Amy703的N端结构域替换为SUMO蛋白,实验结果显示裂解液上清的SUMO/N-Amy条带比Amy703粗亮,验证了SUMO蛋白的促可溶性作用;但纯化后的融合蛋白SUMO/N-Amy的比酶活显著低于N-Amy,仅和野生型Amy703的比酶活相当,表明SUMO与N-Amy的融合显著降低了酶活,同时也预示着N端多一段结构域会影响到催化结构域的结构变化.此外,对SUMO/N-Amy融合蛋白是否与底物结合进行了探讨,为进一步解析Amy703的N端结构域功能提供了实验依据.     

基于神经网络的泡沫混凝土强度及导热性能预测

基于神经网络原理,建立预测泡沫混凝土性能的BP神经网络模型,期望通过输入配合比主要参数,得到泡沫混凝土强度及导热性能的预测结果。将实验数据分为训练组和对照组,对训练组进行非线性拟合,若拟合结果满足误差精度则模型建立完毕;通过拟合结果与对照组的比较,可验证模型预测精度。结果表明,BP神经网络模型能够准确拟合实验数据,利用其泛化能力进行预测的结果与对照组的误差小于8%,该模型具有很高的预测精度。     

单宁微球固定化酶的应用性能

以单宁微球为载体制备固定α-淀粉酶.探讨了温度、pH值、淀粉初始质量浓度、淀粉种类等对单宁微球固定化α-淀粉酶催化淀粉水解性能的影响.结果表明,固定α-淀粉酶在25,60,90℃催化水解淀粉17h后,淀粉的水解百分率均达到95%以上,说明温度对固定α-淀粉酶的催化性能影响不大;pH对固定α-淀粉酶的催化性能影响大,最佳pH值为8;固定α-淀粉酶对可溶性淀粉、番薯淀粉、芭蕉芋淀粉的催化水解率均大于96%;固定α-淀粉酶重复5次后仍具有较好的催化效果.     

基于半连续两部模型的保险损失预测

【目的】提高保险领域中保单累积损失预测的准确率。传统的Tweedie回归模型只能对非零均值建立回归模型,却不能对零概率建立回归模型,从而导致该模型的拟合效果并不理想。【方法】考虑到保单损失数据中往往包含着大量的零索赔,此时可视其为一种半连续型数据。因此,基于半连续两部模型,并考虑到累积损失中非零连续部分的分布类型,提出3种不同的累积损失预测模型,并结合一组实际损失数据进行模型对比分析。【结果】与Tweedie回归模型相比,本研究所提出的半连续两部回归模型的赤池信息准则值(Akaike information criterion, AIC)和贝叶斯信息量准则值(Bayesian information criterion, BIC)更小,具有较好的拟合效果。【结论】本研究结果可为保险领域中的保单累积损失预测提供参考。     

酶解法制备乌鸡蛋白肽的动力学研究

以乌鸡蛋白为底物,研究了木瓜蛋白酶在酶解乌鸡蛋白制备乌鸡蛋白肽时的一级热失活、拟态条件下的米氏常数,建立了考虑底物反竞争性抑制和产物竞争性抑制等影响因素下的反应动力学模型,并根据实验结果求得在70℃下的酶催化水解反应动力学常数Kd为0.011 3min-1,Km为5.70×10-3mol/L,Kcat为1.589 8min-1,并得到了相应的水解度动力学模型和反应速度动力学模型.     

淀粉酶的分类及应用研究进展

淀粉酶是催化水解淀粉分子内糖苷键的一类酶的总称,因其氨基酸序列多样、来源广泛以及性质差异大,分类方法也有多种方式,比较主流的是以淀粉水解产物异头碳的构型来划分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。目前已有多种淀粉酶被成功商业化,广泛应用于各行业中,本文对淀粉酶的一些分类方法及其应用进行综述。     

绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva,再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接,构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达,对重组酶进行SDS-PAGE分析,然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,SDS-PAGE分析发现,在55kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示,重组菌的最适诱导温度为35℃,最适接种量为4%(V/V),最适装液量为30mL。正交实验结果显示,重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25mL,在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株,经发酵条件优化后,重组酶产量显著提高10倍左右。     

长柱沙参中α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选研究

【目的】筛选长柱沙参(Adenophora stenanthina)中α-葡萄糖苷酶抑制.【方法】采用α-葡萄糖苷酶活性抑制模型对长柱沙参不同提取物进行筛选.【结果】在样品浓度为1.25mg/mL时,水提取物、水提醇沉部分、正丁醇萃取部分、乙酸乙酯萃取部分、乙醇提取物、石油醚萃取部分的酶活性抑制率分别为86.39%、73.19%、66.66%、62.81%、55.66%、40.99%.【结论】长柱沙参不同提取物都能抑制α-葡萄糖苷酶活性,其中水提取物的酶活性抑制率最高.     

线性神经网络模型在新上证综指的预测

利用线性神经网络模型对"新上证综指(000017)"进行拟合预测,选取从"新上证综指"开始发行月份(2006年1月)开始到2011年6月的月度数据,共计66个,用前62个做训练组,最后4个数据做预测组,通过比较不同滞后窗口模型的误差平方和,选择适当的窗口数为最优模型,为了提高模拟的效果,对模型的初始数据进行优化,然后进行预测分析;结果显示,拟合效果很好,除6月份股市波动稍大,其他月份拟合误差不到3%,阐释了股票市场的短期可预测性。     

基于机器学习算法的樟子松立木材积预测

【目的】 通过非线性和多种机器学习算法构建并对比不同的立木材积模型,为樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)立木材积的精准预测提供理论依据。【方法】 以大兴安岭图强林业局184株樟子松伐倒木数据为基础,建立非线性二元材积模型(NLR),并通过十折交叉检验和袋外数据(OOB)误差检验的方法得到3种最优机器学习算法,包括:反向神经网络(BP)、ε-支持向量回归(ε-SVR)和随机森林(RF)。对比分析不同模型间的差异,得到最优立木材积模型。【结果】 机器学习算法在立木材积的拟合和预测中均优于传统二元材积模型,具体拟合结果排序为RF>BP>ε-SVR> NLR。其中RF的决定系数(R²)比传统模型的提高了2.00%,均方根误差(RMSE)、相对均方根误差(RMSE%)、平均绝对误差(MAE)分别降低了22.90%、22.93%、36.34%,且与真实值相比平均相对误差(MRB)的绝对值更低,证明了RF在立木材积预测中的优越性。【结论】 机器学习算法作为一种新兴的建模方法可以有效地提高立木材积的预测精度,为森林资源的精准调查和经营管理提供新的解决方案。     

酶法制备粉状木薯淀粉胶黏剂反应条件的研究

【目的】研究利用α-淀粉酶对木薯淀粉进行降解制作粉状木薯淀粉胶黏剂的方法。【方法】通过单因素和正交实验确定酶水解木薯淀粉的最佳工艺条件。【结果】酶水解木薯淀粉的最佳工艺条件为:A2C3B2,即酶用量为1.0%,酶解温度为45℃,酶解时间为15min。按此条件所得的成品木薯淀粉胶的粘合强度为13.9038N·cm-2,粘度为1.0477Pa·S,不添加其他物质,粘合强度强,流动性非常好。【结论】该方法具有低成本,无污染和高效的特点。     

意大利蜜蜂AmCht11基因的克隆鉴定和发育时期表达分析

【目的】克隆鉴定和定量PCR分析不同发育时期意大利蜜蜂(Apis mellifera)几丁质酶AmCht11基因。【方法】克隆测序鉴定AmCht11基因序列,通过多重序列比对分析该基因编码的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测AmCht11蛋白的二级结构、三级结构以及相互作用靶蛋白,构建系统进化树分析该蛋白在几丁质酶家族中的分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCht11基因的组织表达特征。【结果】AmCht11基因c DNA序列全长1 404 bp,编码468个氨基酸;预测AmCht11蛋白质相对分子质量为53.5 k Da,等电点为7.21。多重序列比对和系统进化分析表明,AmCht11蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅷ亚家族成员,该蛋白的氨基酸序列N-端含有跨膜域,具典型的几丁质酶催化结构域,无结合结构域,也不具信号肽。进一步实时定量PCR分析表明,AmCht11基因表达量在意大利蜜蜂幼虫发育第2至第5日龄无明显波动,至幼虫后期第6日龄表达量明显上调。【结论】推测AmCht11基因与意大利蜜蜂幼虫发育后期的蜕皮有关。     

重组毕赤酵母发酵甘油制备α-葡聚糖酶的研究

【目的】考察甘油对组成型毕赤酵母（Pichiapastoris ）生长和α-葡聚糖酶表达量的影响。【方法】采用单因素实验法考察初始发酵培养基中甘油浓度、补料阶段甘油残留和通气量等对α-葡聚糖酶表达量的影响。【结果】发酵培养基中初始甘油浓度从50 g／L提高到150 g／L,菌体生长和α-葡聚糖酶表达量均未受到影响,继续提高到200 g／L时,α-葡聚糖酶表达量明显下降。补料过程甘油残留在0～5 g／L,菌体生长和α-葡聚糖酶表达量最佳,当甘油残留较多时,菌体生长和α-葡聚糖酶的表达量均受到影响。提高通气量有利于增加α-葡聚糖酶的表达量,发酵78 h为宜,在此条件下α-葡聚糖酶酶活力达1763 U。【结论】该工艺优化了以甘油作为碳源制备α-葡聚糖酶的发酵条件,提高了α-葡聚糖酶酶活力,为大规模生产α-葡聚糖酶奠定了基础。     

青钱柳叶多糖不同组分体外降血糖及抗氧化活性研究

【目的】研究青钱柳叶多糖的体外降血糖及抗氧化活性。【方法】以对α-葡萄糖苷酶的抑制作用表示青钱柳叶多糖体外降血糖活性,以总抗氧化能力、清除DPPH自由基、羟基自由基能力和Fe²⁺螯合能力评价其体外抗氧化活性。【结果】青钱柳叶多糖各组分对α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用,且呈现一定的剂量-效应关系。不同醇沉多糖组分中,50%醇沉组分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用最强; 青钱柳叶多糖各组分均具有一定的抗氧化活性,不同醇沉组分清除DPPH自由基能力以及总抗氧化能力由强到弱依次为50% 组分、60% 组分、70%组分、80%组分,而清除羟基自由基能力以及对Fe²⁺螯合能力的强弱正好相反。【结论】青钱柳叶中含有的多糖组分具有良好的体外降血糖和抗氧化活性,可进一步加工利用。