利用二代测序数据判定SNP基因型

通过将二代测序数据与连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR)对单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因分型的结果进行比对,确定二代测序数据判定SNP基因型的经验性阈值.利用多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,multiplex PCR)对91个样本进行19个SNP位点的扩增,扩增的产物混匀纯化后在Ion torrent PGM仪器上进行二代测序.利用LDR技术对相应的SNP位点进行检测,将其分型结果作为二代测序数据判定SNP基因型的标准,确定了二代测序数据判定SNP基因型的阈值:测序深度≥6X,等位基因比率在15%~85%的位点为杂合子,在范围之外的为纯合子,该阈值准确度达到99.6%;针对等位基因频率分布在阈值边缘的数据,结合聚类分析可将正确率提升至100%.研究结果为利用二代测序数据判定SNP基因型提供了一个准确、快捷和经验性的阈值与方案.     

应用SNaPshot技术对桉树SNP的检测

【目的】SNaPshot是一种单核苷酸多态性(SNP)检测的多重分析技术,具有检测速度快、准确性高、成本低廉等特点。利用多重PCR技术,结合SNaPshot分型方法,在桉树中构建SNP复合分型检测体系,促进SNP技术在桉树遗传图谱构建和无性系鉴定的应用。【方法】利用桉树已有的EST序列设计引物,通过PCR产物直接测序进行SNP标记位点的开发,利用多重PCR技术和SNaPshot分型方法建立SNP复合分型检测体系,并在尾叶桉和细叶桉作图群体的两亲本和6个F₁子代,以及16个国内常用的桉树无性系中进行分型检测。【结果】共设计合成12对SNP引物,分为3组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)建立了SNP复合分型检测体系,SNP分型情况与测序结果一致。对桉树作图群体的两个亲本和6个F₁子代的分型结果进行统计,发现12个SNP标记在6个子代中均发生了分离; 对桉树无性系进行多态性的分析,期望杂合度(H_e)为0.11～0.51、观测杂合度(H_o)为0.11～0.56,多态性信息含量(PIC)为0.10～0.37,表现为中度或低度多态性。【结论】利用多重PCR和SNaPshot技术可以快速地对桉树进行基因分型,其结果准确可靠,可以用于桉树遗传图谱的构建以及桉树无性系的鉴定等方面研究。     

翘嘴鳜淀粉酶基因SNPs和微卫星位点多态性的检测

本研究主要检测翘嘴鳜淀粉酶(amylase,AMY)基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)和微卫星位点多态性.实验采用PCR产物直接测序法(PCR-direct sequencing,PCR-DS)检测翘嘴鳜AMY基因组序列的SNPs和微卫星位点,并使用创造限制酶切位点PCR法(created restriction sites PCR,CRS-PCR)和PCR-DS法对SNPs进行分型,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测AMY基因微卫星位点的多态性.实验结果发现AMY基因第1内含子有一个SNP位点A1,第5内含子有3个SNPs位点(A2、A3和A4);此外,第5内含子中还存在一个微卫星位点B1,共检测到4个等位基因,有9种单倍型.在翘嘴鳜群体中,4个SNP位点呈中度遗传多样性,而微卫星位点表现出高度遗传多样性.     

新疆维吾尔族人TNFβ-804基因多态性与乙型肝炎易感性的相关性研究

目的:研究TNF-β基因单核苷酸多态性(SNP)804位点与新疆地区维吾尔族人乙型肝炎之间的关系。方法:用套式PCR(nested PCR)和等位基因特异性PCR(allele一speciicfic PCR,AS-PCR)法,对120例乙肝患者和120例正常对照者TNF-β基因SNP804多态性位点进行基因分型。结果:SNP804多态性位点C/C基因型和C/A+AA基因型频率在病例组为77%和23%,正常对照组为88%和12%,两组间基因型和等位基因频率分布差异有显著性(p<0.05)。结论:TNF-β804多态性位点与新疆维吾尔族人乙肝有明显相关性。     

拉布拉多犬与金毛猎犬毛色基因MC1R(R306ter)与TYRP1(Q331ter)SNP位点的检测

目的建立犬毛色基因MC1R R306ter(c.C916T)与TYRP1 Q331ter(c.C991T)SNP位点的检测方法。方法采用PCR/测序的方法,对19只拉布拉多犬和15只金毛猎犬的MC1R基因c.C916T SNP位点及TYRP1基因c.C991T SNP位点的多态性进行检测,根据MC1R和TYRP1的多态性对犬的毛色基因型进行分析。结果 PCR/测序法能够对TYRP1基因c.C991T SNP位点进行明确和有效的检测。但MC1R基因c.C916T SNP位点的测序结果出现了特殊峰,经克隆/测序法确认该特殊峰型为杂合性SNP位点。毛色基因型分析表明,金毛猎犬的毛色基因型皆为纯合的eeBB(15只),未见其他基因型。拉布拉多犬的毛色基因型分别为:黑色犬EeBB(6只)、EeBb(2只);黄色犬eeBB(9只)、eeBb(2只)。未发现其他如EEBB和EEBb(黑色)、eebb(黄色)的毛色基因型。另外,拉布拉多犬样本中没有巧克力色犬,也未检测出其相应的Eebb和EEbb基因型。结论本研究成功建立了犬毛色基因MC1R R306ter(c.C916T)与TYRP1 Q331ter(c.C991T)SNP位点的检测方法,为分析毛色基因型与导盲犬培训成功率之间的相关性提供了前期工作基础。     

载脂蛋白E和SHCP66的基因单核苷酸多态性及其与长寿性状的相关研究

研究载脂蛋白E（Apolipoprotein E,APOE)和SHCP66（Src homology-domain cotaining protein,66ku)的基因在一个中国隔离人群中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP)，以及它们与长寿性状的相关性，应用多聚酶链式反应结合测序技术对2个基因的外显子区域进行小样本（40个随机个体）的单碱基多态位点（SNP）检测，并对其中apoe的2个侯选位点在大样本中进行基因分型，结果在apoe基因中发现3个SNP位点，其中一个在调控区内的位点是首次报道，shcp66发现3个SNP位点和一个缺失突变，均为首次报告.apoe的2个候选位点在隔离人群中的长寿个体及对照组中基因频率的卡方测验显示无显著差别（P＞5％），因此，在该长寿人群中，该基因的多态现象与长寿性状无显著的关联。     

肝癌染色体高频缺失区肿瘤相关基因cSNP在HBV患者和正常人群中的多态分布研究

从定位于肝癌高频缺失区的肿瘤相关基因入手,查询单核苷酸多态性(SNP)数据库信息,获得编码区SNP(cSNP)序列,设计引物,根据SNP位点设计寡核苷酸探针,构建SNP芯片．分别从正常人和HBV患者血样中提取基因组DNA,PCR扩增标记含SNP位点的序列,将地高辛标记的PCR产物与SNP芯片杂交．结果表明,正常人基因组与HBV患者基因组肿瘤相关基因SNP之间存在差异,检测到EGFL3(rs947 345),Gas- pase9(rs2 308 950),E2F2(rs3 218 171)三个cSNP位点的基因频率在两组人群中差异显著．HBV患者中存在的高频多态位点可能与其肝癌易感性相关．     

拉布拉多犬与金毛寻回猎犬基因组中与髋关节发育不良相关基因COL6A3、FN1的SNP位点检测

目的 检测拉布拉多犬与金毛寻回猎犬基因组DNA中与髋关节发育不良密切相关的COL6A3基因、FN1基因中的3个SNP位点,以期为拉布拉多犬与金毛寻回猎犬幼犬的选育提供有效的遗传学诊断方法。方法 全国范围内募集经过影像学诊断的髋关节发育不良的拉布拉多犬8只、金毛寻回猎犬5只,中国导盲犬大连培训基地提供经影像学诊断的健康的拉布拉多犬23只、金毛寻回猎犬7只作为实验对象,静脉采血,提取血细胞的基因组DNA样本,采用PCR/测序方法对COL6A3基因上的2个SNP位点(CFA25∶51031100,51040259)和FN1基因的1个SNP位点(CFA37∶25095511)进行基因型检测,并统计分析SNP位点的基因型与髋关节发育不良的关联度。结果 COL6A3(CFA25∶51031100,51040259)和FN1(CFA37∶25095511)SNP位点的基因型与犬的髋关节发育不良没有显著相关性(P>0.05)。结论 COL6A3(CFA25∶51031100,51040259)和FN1(CFA37∶25095511)SNP位点均不能成为拉布拉多犬与金毛寻回猎犬髋关节发育不良的实用性遗传学诊断指标。     

齐兴肉兔和伊拉兔MC4R、GHR基因SNP的检测

为了探索兔黑素皮质素受体-4 (MC4R)、生长激素受体(GHR)基因的部分单核苷酸多态性(SNP)及其与不同兔品种生长速度之间的关联,试验采用Chelex 100从齐兴肉兔和伊拉兔(n=60)血中快速提取基因组DNA,用PCR扩增MC4R、GHR基因部分片段并直接测序.结果发现:两品种兔GHR基因检测出1个SNP位点g.63343609 TG,为同义突变,该位点仅检测到G等位基因;MC4R基因检测出5个SNP且均为同义突变,各个位点的基因型频率在齐兴肉兔和伊拉兔之间存在不同程度的差异.推测MC4R基因的单核苷酸多态性可能与兔的生长速度有关联.     

健康人外周血中A20基因3'UTR突变与多态性分析

目的:建立检测NF-κB负调控因子A20基因3'非编码区(3'UTR)单核苷酸多态性(SNP)和突变的方法和rs77191406的检测方法.方法:利用PCR扩增99名健康人外周血单个核细胞(PBMCs)DNA的A20基因3'UTR全长片段,并对PCR产物进行核苷酸序列分析.将所测A20 3'UTR序列与Gen Bank中的序列(NM_006290.3)通过BLAST程序对比,检出可能存在的基因突变.利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测A20基因SNP rs77191406位点多态性.结果:在A20 3'UTR mRNA 3080位点检测出CT突变,该突变在基因库中已有作为SNP登记(rs77191406),该SNP在7例(7.07%)健康人样本中检测到,但并未发现其他突变和多态性.成功建立PCR-RFLP检测A20基因SNP(rs77191406)的方法.结论:首次报道中国健康人群中A20基因3'UTR存在rs77191406,其意义有待进一步明确.     

新疆维吾尔族人TNFβ-804基因多态性与乙型肝炎易感性的相关性研究

目的：研究TNF-β基因单核苷酸多态性（SNP）804位点与新疆地区维吾尔族人乙型肝炎之间的关系。方法：用套式PCR（nested PCR）和等位基因特异性PCR（allele一speciicfic PCR,AS-PCR）法,对120例乙肝患者和120例正常对照者TNF-β基因SNP804多态性位点进行基因分型。结果：SNP804多态性位点C/C基因型和C/A＋AA基因型频率在病例组为77%和23%,正常对照组为88%和12%,两组间基因型和等位基因频率分布差异有显著性（p〈0.05）。结论：TNF-β804多态性位点与新疆维吾尔族人乙肝有明显相关性。     

拉布拉多犬髋关节发育不良相关基因的SNP位点的检测

目的检测拉布拉多犬基因组DNA中与髋关节发育不良密切相关的5个基因中的6个SNP位点,以期为拉布拉多犬的选育提供有效的遗传学诊断方法。方法经影像学诊断,筛选出典型的6只髋关节发育不良和11只正常拉布拉多犬作为实验对象,采取静脉血,提取血细胞的基因组DNA样本,采用PCR/测序方法对17个样本的5个基因中的6个SNP位点:LAMA2(CFA1:70997779),LRR1(CFA8:29247021),SCR(CFA24:28944481),COL6A3(CFA25:51031100,51040259)和FN1(CFA37:25095511)进行变异型检测,并统计分析SNP位点的变异型与髋关节发育不良犬关联度。结果 LAMA2(CFA1:70997779),LRR1(CFA8:29247021),SCR(CFA24:28944481),COL6A3(CFA25:51031100)和FN1(CFA37:25095511)SNP位点的变异型与拉布拉多犬的髋关节发育不良没有显著相关性(P0.05)。COL6A3(CFA25:51040259)SNP位点的A/A型与拉布拉多犬的髋关节发育不良存在极显著相关性(P=0.007)。结论 COL6A3(CFA25:51040259)SNP位点的A/A型可能成为拉布拉多犬髋关节发育不良的实用性遗传学诊断指标,但尚需大样本确认。     

新疆柯尔克孜族人群PPARG基因31个SNP位点的遗传多样性及其与2型糖尿病的关联

 应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间(MALDI-TOF-MS)质谱技术对SNP 位点进行基因分型的方法,检测并分析100例(对照正常个体50 例,糖尿病患者50 例)无血缘关系的柯尔克孜族隔离人群过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)基因31个单核苷酸多态性(SNP)位点的遗传多样性,探讨PPARG 基因31 个SNP 位点的遗传多样性及其与柯尔克孜族2 型糖尿病(T2DM)的关联,筛查预测2 型糖尿病的分子标记。结果发现,PPARG 基因所选的31 个SNP 位点中有23 个具有多态性(MAF≥0.05)。两组间分别在血压(SBP、DBP)、腰臀比值、血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白水平有显著差异(P<0.01)。rs1801282、rs1899951、rs2881654、rs2972162 位点基因分型在对照组和病例组中的分布均有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。非条件Lo-gistics 回归分析显示,PPARG 基因中rs1801282、rs1899951、rs2881654、rs2972162 等位点变异等位基因频率组间比较差异均有统计学意义(OR 值分别为2.639、2.639、1.774、2.639,均为P<0.05)。在男女对照组中rs1899951、rs2292101、rs2881654、rs1801282 和rs6782475 位点等位基因频率均有显著性差异(P<0.05),在男女病例组中rs4684846、rs7615916、rs9817428、rs4684846、rs709151、rs7615916 位点等位基因频率均有显著性差异(P<0.05)。结果显示,PPARG 基因的4 个SNP(rs1801282、rs1899951、rs2881654、rs2972162)位点变异与柯尔克孜族人T2DM 可能存在关联。     

基于RAD-seq技术的鹅掌楸基因组SNP标记开发

【目的】开发大量可靠的SNP标记,为鹅掌楸高密度遗传连锁图谱的构建和基于基因组的林木选择育种提供分子基础。【方法】从北美鹅掌楸NK基因型为母本、鹅掌楸LS基因型为父本的F1代杂交群体中,选取198株个体为作图群体。用限制性内切酶EcoR I对包括2个亲本和198个子代在内的200个单株的基因组DNA进行酶切,构建RAD(restriction-site associated DNA)文库并进行RAD-seq测序。采用读长为91 bp的双末端测序。2个亲本的平均测序深度为2×,198个子代的平均测序深度为0.8×,平均产量为1.94 Gb,共获得约387.21 Gb数据。用Stacks软件将每个样品的RAD-reads作生物信息学分析,对候选位点进行卡方检验和缺失率检验,再将符合孟德尔遗传的标记及与之相对应的RAD-tag序列和鹅掌楸参考基因组序列进行比对。最后,从本研究开发的SNP标记中选取27个候选SNP位点,设计引物,对随机挑选的16个F1代进行PCR扩增并将结果进行测序,同时验证SNP的有效性。【结果】从候选群体中共鉴定到22 019个SNP位点,符合孟德尔遗传规律的标记为4 233个,最终获得3 501个候选SNP标记。SNP验证中,共有293个SNP标记完成测序并能判读结果,所有位点都为SNP位点,共有194(66.2%)个SNP变异类型得到了验证。 【结论】基于RAD-seq技术和鹅掌楸参考基因组序列为基础的策略,能够作为一种快速有效的手段,实现大规模的分子标记开发,可用于鹅掌楸等林木的高密度遗传图谱的构建。     

拉布拉多犬神经类型相关基因SNP的分析

目的检测拉布拉多犬基因组DNA中与神经类型密切相关的4个基因中的6个SNP位点,以期为拉布拉多犬神经类型的早期鉴定提供分子遗传学鉴定指标。方法依据中国导盲犬大连培训基地成熟的导盲犬神经类型行为学评估标准,选取典型的安静、活泼、胆小型(弱型)三种神经类型的犬各4只为研究对象,采取静脉血,提取血细胞的基因组DNA样本,采用PCR/测序方法和PCR-RFLP分析法对12个样本4个基因的6个SNP位点:COMT(G482A)、MOAB(T199C)、ABCB1(A985T、T3442C、377-378 ins C)、GNB1L(961-962 ins G)进行变异型检测,并统计分析SNP位点的变异型与神经类型的关联度。结果 COMT基因G482A SNP位点的G/A型在胆小型犬中所占比例显著高于其在活泼型和安静型中所占比例(P=0.014;P=0.014),A/A型在活泼型犬中所占比例显著高于安静型和胆小型中所占比例(P=0.025;P=0.025);MAOB基因T199C SNP位点的T/C型在安静型犬中所占比例显著高于其在活泼和胆小型犬中所占比例(P=0.025;P=0.025);ABCB1基因A985T SNP位点的T/A型在活泼型犬中所占比例显著低于其在安静和胆小犬中所占比例(P=0.014;P=0.014);ABCB1基因T3442C SNP位点的T/C型在胆小型犬中所占比例显著高于其在活泼和安静型犬中所占比例(P=0.025;P=0.025);ABCB1基因的377-378 ins C和GNB1L基因的961-962 ins G均没有发现显著性差异(P0.05)。结论 COMT基因G482A SNP位点的G/A型和A/A型,MAOB基因T199C SNP位点的T/C型,ABCB1基因A985T SNP位点的T/A和ABCB1基因T3442C SNP位点的T/C型与拉布拉多犬神经类型具有显著相关性,可做为拉布拉多犬神经类型早期鉴定的分子遗传诊断指标,但尚需大样本确认。     

Multiplex chimeric primers used in a tetra-primer amplification refractory mutation system PCR to detect two single nucleotide polymorphisms associated with ovarian cancer

目的:建立一种简单快速的方法,可同时检测两个卵巢癌相关单核苷酸多态性位点rs608995和rs749292.方法:采用多重嵌合引物策略改进四引物扩增受阻突变体系聚合酶链式反应(PCR),通过设计rs608995和rs749292的特异性嵌合引物,经单管一次PCR,琼脂糖电泳分析产物长度.结果:对46份全血样本,电泳结果均与测序一致,可准确分型.结论:经多重嵌合引物策略改进的四引物扩增受阻突变体系PCR可简便、快速、准确的获得2个位点的分型结果.     

舟山带鱼线粒体COI基因SNP位点分析

为探讨舟山带鱼种质状况,本研究利用直接测序法对舟山带鱼线粒体COI基因进行SNP挖掘分析,获得长度一致的985 bp基因片段,检测到22个SNP位点,对SNP位点在样品中分布情况分析,发现部分SNP位点分布情况类似甚至完全相同,推测基于线粒体COI基因片段不同位点突变可能存在关联性。     

BMP7基因多态对大白猪生长性状的影响

目的为了筛查猪BMP7基因SNP位点及分析其对猪生长性状的影响。方法通过PCR产物测序确定BMP7基因外显子上的5个潜在多态位点,用sequenom法对实验猪群进行基因分型并开展基因型与猪生长性状的关联分析。结果在BMP7基因5个潜在SNP位点中检测确定了2个SNP位点:A83509G和G84966A,且均属错义突变。A83509G位点AA型校正达100 kg日龄显著低于AG型和GG型(P0.05),GG型校正达100 kg眼肌面积显著高于AG型(P0.05); G84966A位点GG型校正达100 kg日龄和达100 kg眼肌面积都显著高于AA型(P0.05);在A83509G和G84966A位点单倍型中,AGGA、AAAA型个体校正达100 kg日龄显著低于AGGG基因型个体(P 0.05); AGGA基因型个体校正达100 kg眼肌面积显著高于AGAA基因型个体(P0.05)。结论 A83509G、G84966A变异位点对大白猪眼肌面积及生长速度具有显著影响,可作为猪生长性状选择的潜在分子标记。     

Calpain 10基因与新疆维吾尔族2型糖尿病遗传易感性研究

研究Calpain 10基因单核苷酸多态性（SNP）43G-A和63C-T两个位点与新疆地区维吾尔族人群2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）之间的关系。采用1∶1病例——对照研究方法,以聚合酶链式反应——限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）技术,对120例T2DM患者和120例正常对照者Calpain 10基因SNP43、SNP63多态性位点进行基因分型。SNP43多态性位点的基因型和等位基因频率在病例组和正常对照组中的分布存在差异,T2DM组中GG基因型和等位基因频率均低于对照组,但是A等位基因频率高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.005）;SNP63多态性位点的基因型频率和等位基因频率在病例组和正常对照组中的分布无显著差异,（P〉0.005）。结果表明：（1）Calpain 10基因SNP43多态性位点与新疆地区维吾尔族人群T2DM有明显相关性;（2）SNP63多态性位点与新疆地区维吾尔族人群T2DM无明显相关性。     

应用T载体连接PCR技术分离黄嘴白鹭微卫星位点

传统的微卫星分离策略对于低丰度的物种如鸟类而言,通常是低效的.探讨了一种改良的T载体PCR序列获取法用于黄嘴白鹭(Egretta eulophotes)微卫星DNA的分离,称为T载体连接PCR(T-vector-ligation PCR,TVL-PCR).在获取第一侧微卫星序列的71个阳性克隆中,59个克隆含有重复序列,设计了48对位点特异巢式引物.经过两轮TVL-PCR后,31个位点的扩增产物为预期大小,经测序后获得21个完整的微卫星位点.除去侧翼序列过短和小卫星位点外,设计16个微卫星位点进行多态信息检测,其中7个位点显示出多态性,平均等位基因数为2～20,观察杂合度(HO)和期望杂合度(HE)分别为0.375～0.958和0.477～0.956,所有位点都符合哈迪-温伯格平衡(HWE)和连锁平衡.说明TVL-PCR技术对低丰度微卫星物种的位点分离具有一定的应用价值.