雌核发育棕点石斑鱼EST-SSR的开发验证

通过人工雌核发育棕点石斑鱼(Epinephelus fuscogutatus)的转录组序列,共获得了24 359个微卫星位点,棕点石斑鱼转录组的微卫星重复基序具有不同的分布特征,其中以单碱基(34.05%)、二碱基(37.58%)和三碱基(22.75%)为主要的EST-SSR基序重复类型.根据微卫星引物设计原则,随机筛选了93个EST-SSR位点来进行引物合成和多态性检测,最终开发了48个具有多态性的微卫星标记,并在不同棕点石斑鱼群体中进行了初步的验证.结果显示:每个位点等位基因数(Na)为2～22,平均等位基因数为9;观测杂合度(H_0)为0.111～1.000,期望杂合度(He)为0.636～0.940;多态信息含量(PIC)为0.538～0.922个,表明48个EST-SSR位点均表现出高多态性(PIC 0.5).结果表明:基于雌核发育棕点石斑鱼转录组数据,开发微卫星标记是可行的.本研究所开发的具有多态性的微卫星标记可应用于棕点石斑鱼及其近缘种的遗传多样性分析和分子标记辅助育种研究.     

藏羚羊(AAC)_n微卫星富集文库构建与引物筛选

基于磁珠富集法,利用生物素标记的寡核苷酸探针(AAC)8从藏羚羊(Tibetan antelope)基因组酶切的300~1000bp片段中筛选微卫星位点,纯化的富集片段连接到pCR@2.1载体和转化到Trans5α感受态细胞.随机挑取180个白斑克隆,PCR检测到条带数大于或等于2的阳性克隆为56个,阳性率为31.1%.对阳性克隆测序,获得43条含微卫星座位的序列,微卫星重复次数在5~20次之间.舍弃不适宜设计引物的微卫星座位,试验设计并合成了20对微卫星引物;以3个样点(青海、新疆、西藏)的24个藏羚羊基因组为模板进行PCR扩增,获得8对可得到稳定扩增产物的微卫星引物,其中4对引物的扩增产物具有多态性,座位分别为AAC050、AAC056、AAC165和AAC477.上述引物可用于藏羚羊及近缘物种的遗传多样性、种群遗传结构等研究.     

中药植物玉竹微卫星标记的筛选及遗传多样性分析

利用磁珠富集法构建玉竹的微卫星文库,用筛选出的微卫星引物对玉竹样品进行遗传多样性分析。根据链亲和素磁珠和生物素特异结合的特性,用3’端生物素标记的探针与两端连接已知序列人工接头的玉竹基因组DNA酶切片段杂交,杂交复合物结合到包被有链亲和素的磁珠上,洗脱并收集吸附在磁珠上的含有微卫星的片段。经过克隆和测序,再根据微卫星两侧的保守序列设计引物,最后利用从中筛选出的微卫星引物对玉竹种群进行遗传学分析。从基因组微卫星富集文库中分离出9个多态微卫星位点,来自3个玉竹种群的40个个体的多态性显示,每个位点的等位基因数从3到6个不等,观察杂合度范围为0000～0.875,预期杂合度范围为0.520～0.760,多态信息含量范围为0.066～0.687。9个多态位点经哈温平衡检测结果显示有5个位点符合哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡,其余4个位点显著偏离哈温平衡(P0.05)。这可能是存在无效等位基因和或近亲繁殖效应的结果,鉴定出的微卫星遗传标记可以在玉竹的遗传多样性和种群遗传结构的评价中具有潜在的应用价值。     

封闭群比格犬微卫星的筛选及初步应用

摘要:目的 筛选可用于比格犬遗传检测的微卫星位点,并对小型比格犬群体进行了遗传结构分析。 方法 选取来自文献的微卫星位点 120 个,包括比格犬位点 23 个和其他犬类遗传检测的位点 97 个。 用 DNA 池对这些位点进行 PCR 条件优化后,挑选扩增效果优良的位点对常用比格犬群体进行荧光标记 STR 扫描和群体遗传结构分析,依据期望杂合度( He)和香农指数挑选符合要求微卫星位点计算群体遗传参数。 结果 在候选的 120 个位点中共有73 个位点扩增效果优良,STR 扫描后选用 49 个位点进行遗传分析,结果显示该群体有效等位基因数、期望杂合度、平均杂合度、香农指数、多态性信息含量分别为 4. 9230、0. 7574、0. 7375、1. 6625、0. 7038,证明该群体遗传多态信息丰富,群体遗传多样性高。 结论 所选 49 个微卫星位点可用于比格犬遗传检测,这些位点还需用更多群体进行验证和优化。     

Hartley 豚鼠生物净化群体建立及微卫星遗传质量分析

摘要:目的 对现有 Hartley 豚鼠种群进行剖腹产净化,通过遗传检测,确认净化后的种群符合封闭群遗传特征。方法 生产群中不同繁殖单元广泛选择雌、雄个体,按 1 ∶ 1 比例合笼交配,于合笼后 70 d 实施剖腹产手术,仔鼠人工乳饲喂。 用循环交配法繁殖一代,从 F1 代中选取 30 个个体采集耳部组织样本,提取 DNA,应用 18 个豚鼠基因组微卫星位点进行 遗 传 检 测。 结 果 剖 腹 产 共 获 得 85 只 仔 鼠,成 活 56 只,离 乳 47 只 ( 23 雄、24 雌) ,成 活 率65. 9% ,离乳率 83. 9 % ;18 个豚鼠微卫星位点共检测到 81 个等位基因,平均杂合度 0. 5747,平均多态信息含量( PIC)0. 5216。 Hardy-Weinberg 遗传平衡检测,14 个位点符合 H-W 遗传平衡,3 个位点显著偏离 H-W 遗传平衡,1个位点呈现纯合状态。 结论 通过剖腹产对豚鼠种群进行了净化,净化后的群体具备较理想杂合度,属高度多态性群体,符合封闭群实验动物遗传特征。     

舟山附近海域3个大黄鱼养殖群体遗传多样性的微卫星分析

利用8个微卫星多态标记分析舟山附近海域3个大黄鱼养殖群体共90个体的遗传多样性。结果显示,8个微卫星位点共检测到等位基因64个,各位点等位基因数(A)范围为5~10个,观测杂合度(Ho)的平均值为0.9111,期望杂合度(He)的平均值为0.8108,多态信息含量(PIC)平均值为0.7800,表明所选择的8个微卫星位点均表现出较高的多态性。群体的遗传多样性分析结果显示,3个群体的平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为0.891 7、0.900 0、0.941 7和0.738 4、0.743 2、0.821 3,Shannon多样性指数分别为1.467 0、1.449 0、1.800 9,表明3个群体的遗传多样性处于较高水平。HardyWeinberg平衡检验发现只有LYC0015和LYC0009位点处于平衡状态(PHW0.05),其余6个位点都不同程度地偏离了平衡。3个群体的聚类分析表明,岱山和朱家尖西岙网箱2个养殖群体亲缘关系较近,而与舟山市水产所耐低温F2代群体亲缘关系较远。     

刺参CT/AG微卫星标记的筛选

利用5’锚定引物PCT筛选刺参的CT/AG微卫星分子标记,测序的43个克隆子中,42条序列含有微卫星DNA序列,阳性克隆比率达到97.7%。去除重复序列后,共检测到56个微卫星位点,分布于26条序列中,其中25条序列检测到2个或2个以上微卫星位点。对所有筛选到的微卫星位点进行分类统计后表明,核心序列为(CT/AG)的有51个(91.1%),5个位点为其他类型的重复。结果表明:刺参CT/AG微卫星标记在刺参基因组中含量较丰富,5’锚定引物法在筛选特定标记的同时,还筛选了其他类型的微卫星标记,具有较强的筛选效率。     

基于高通量测序的鹿角杯形珊瑚微卫星标记的开发

为了更深入开展珊瑚遗传结构及其多样性研究,本研究采用高通量测序对鹿角杯形珊瑚进行微卫星标记的开发。首先用人工白化的方法获得污染较低的鹿角杯形珊瑚,然后使用该样品DNA,基于高通量测序平台对鹿角杯形珊瑚简化基因组进行了测序,最终设计得到鹿角杯形珊瑚微卫星引物2 786对。利用海南三亚鹿角杯形珊瑚对其中6对多态性较高的微卫星标记进行了评价。每个微卫星位点的有效等位基因数(Ne)为2.198～5.000;观测杂合度(Ho)为0.531～0.875;期望杂合度(He)为0.512～0.816;Shannon多样性指数为0.856～1.829;多态信息含量(PIC)为0.441～0.777,其中有4对微卫星标记呈现为高度多态性(PIC 0.5),2对微卫星标记为中度多态性。经过Bonferroni校正后,只有微卫星标记LB11偏离哈迪—温伯格平衡;连锁不平衡检验结果表明,位点之间不存在连锁不平衡现象。     

萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)的ISSR引物筛选及其多态性检验

采用简单重复序列区间(ISSR:一种基于微卫星的分子标记,无需预知遗传背景即可研究基因组中微卫星序列的变异,适合大规模的种群遗传研究)的方法对萼花臂尾轮虫(Brachionus calyci florus)进行PCR扩增,优化出适宜的ISSR-PCR反应体系,并从100条引物中筛选出16条具有良好多态性和重复性的ISSR引物.研究结果显示,萼花臂尾轮虫简单重复序列以(AC)和(AG)的两碱基重复为主,筛选出的ISSR引物扩增共得到114个位点,66个多态位点,多态性高达57.89%,高于常用于该物种分子生态学研究的线粒体COI基因的多态性.     

宝石鲈与淡水黑鲷及其子一代微卫星位点分析

使用11对微卫星引物对杂交父本宝石鲈(Scortum barcoo)和母本淡水黑鲷(Hephaestus fuliginosus)及其子一代胜斑(F1)进行分子遗传机制研究,结果表明:(1)在11个微卫星位点中,淡水黑鲷有10个位点得到扩增产物,F1有9个位点得到扩增产物,而宝石鲈只得到6个位点的扩增产物,5个位点能在3个种类中稳定扩增;(2)宝石鲈、淡水黑鲷及其F1这3个群体在这5个位点中的平均等位基因数(Ao)为2.000 0、3.000 0、2.200 0;平均有效等位基因数(Ae)分别为2.000 0、2.719 8、2.133 3;平均观测杂合度(Ho)均为1.000 0;平均期望杂合度(He)分别为0.545 5、0.672 7、0.572 7;平均多态信息含量(PIC)为0.375 0、0.537 6、0.410 9;平均Shannon信息指数(I)分别为0.693 1、1.022 7、0.762 5;(3)F1与宝石鲈和淡水黑鲷的遗传相似性系数分别为0.974 7和0.839 8,遗传距离分别为0.025 6和0.174 6.根据Nei's遗传距离建立的UPGMA聚类图表明杂交F1与2亲本的遗传差异不是对等的,而是偏向父本宝石鲈一方.     

杉木EST-SSR与基因组SSR引物开发

利用已经公布的杉木444条EST序列和未公布的杉木基因组文库中1 142条基因序列,进行引物开发效率的比较。去冗余后,利用MISA 搜索SSR 位点,分别得到109个和39个含有SSR的 位点。杉木EST序列中SSR分布密度为964.58个/Mbp,基因组中平均每Mbp出现1 037.24个SSR。在两个独立来源的数据库序列中,六核苷酸重复均为最多的重复类型,且AT-rich的重复类型占较大比例。AGC/CTG是杉木EST序列和基因组库中最多的三碱基重复,通过Primer 3.0分别设计出SSR引物95对和37对。为考察设计引物在杉木不同种源(群体)中的有效性,取12个种源(个体)的优良个体, 利用随机抽取的10个EST-SSR和8个gSSR(基因组SSR)进行引物筛选,结果表明:EST-SSR和gSSR各有4对引物在12个种源(个体)中表现出明显的多态性,多态率分别为40%和50%。8对多态性的SSR引物共扩增出 25 个多态性等位位点,平均每个引物产生 3.125 个多态性等位位点,平均有效的等位位点为2.399 5,PIC平均值为0.519 1; Hot平均为0.307 4。其中gSSR标记在检测群体间存在较大的分化,4个gSSR比4个EST-SSR扩增出更多的等位位点数、平均等位位点数,以及更大的PIC值。     

不结球白菜SSR引物的高效开发及其通用性研究

利用改进的ISSR-PCR分离不结球白菜基因组微卫星,进行两步PCR,分别设计出SSR两端引物IP2和IP3（即SSR引物对）,SSR引物产率为12%,明显高于传统方法.不结球白菜SSR序列以（GA）n为主,占70%.将69对SSR引物用于芸苔属其它8种作物的扩增,97%引物有显著扩增,扩增率最高的为四倍体白菜和甘蓝（85.5%）,最低的为青花菜（49.3%）.10对为通用引物,在所检测的8种作物中片段大小一致,其余的扩增片段和数目差异较大,表现出较为丰富的多态性.尤其是在C基因组的甘蓝和花椰菜上,最多可检测到5个位点,表明运用lSSR-PCR开发出的引物多态性较高.     

草鱼基因组随机扩增多态性引物及多态性位点的筛选

为了建立草鱼基因组DNA多态性分析的指标体系,应用RAPD技术,从180条10碱基随机引物中筛选出了31条能扩增出多态性DNA片段的引物。用这31条多态性引物共扩增出了327条重复性好、带型清晰、分辨率高的谱带。扩增产物的片段大小范围在400—2000bp之间。单一引物扩增条带为5—14条。用这些多态性引物在草鱼基因组DNA中检测到了93个多态性位点,并对这些多态性位点上的等位基因频率进行了统计分析。这31条多态性引物和所检测到的93个多态性位点初步为草鱼基因组的多态性分析提供了可靠的分析指标体系。     

微卫星标记在人参和西洋参鉴别中的应用

从GenBank中寻找含有简单重复序列(SSR)位点的人参DNA片段序列,设计SSR引物,挑选PCR扩增条带清晰的引物,对人参和西洋参进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,选择能够区别2个种的引物.共有来自8个SSR位点的9对引物能扩增出可区分人参和西洋参的特异性片段,其中7对SSR引物在西洋参中能稳定地扩增出特异性...     

近交系小鼠微卫星DNA引物的筛选和Tm值优化研究

目的通过对近交系小鼠微卫星引物的筛选和Tm值优化研究,以探索小鼠DNA多态性检测方法。方法随机选用32对位于小鼠不同染色体的微卫星引物,用PCR扩增方法对常用C57BL/6、C3H、BALB/c、DBA/2、129、FVB及SCID近交系小鼠DNA多态性进行扩增和电泳分析,并对其中25对引物的Tm值进行优化。结果 25对引物可稳定扩增,2对引物在不同品系小鼠间表现为单态性,23对引物在不同品系间呈多态性,10对引物呈显著多态性(3～4个态性)。结论所筛选和优化的25对微卫星引物,对不同品系小鼠DNA可稳定扩增,其电泳结果具有较高的DNA多态性,可反映不同品系小鼠的遗传概貌。     

基于松材线虫全基因组序列的SSR标记开发

为了研究松材线虫在我国的群体遗传关系及传播路径,获得更为稳定的松材线虫分子标记,使用MISA软件对松材线虫全基因组10 432条DNA片段进行搜索,共获得95个gSSR位点。其中,二核苷酸重复出现频率最高,占全部SSR位点的66.3%。依据所有gSSR位点共设计出36对引物,以1份松材线虫DNA pooling(包含我国46个不同地理来源的松材线虫虫株DNA)为模板进行PCR,产物由QIAxcel全自动凝胶电泳分析系统检测,获得17对可能具有多态性的gSSR引物。进一步对这17对引物的PCR产物进行单克隆试验并测序,BioEdit软件拼接比对结果表明,其中9对确实具有多态性。     

重庆市常用及新选玉米自交系SSR指纹图谱构建

选用32对玉米SSR引物检测重庆市部分常用及新选玉米自交系间的遗传差异,基于扩增带型清晰、稳定和易于统计原则,从中筛选10对引物作为构建66个玉米自交系指纹图谱的核心引物.结果表明,共扩增出31个条带,每对引物检测到条带3~4个,平均为3.10个.多态性信息量(PIC值)变幅为0.487~0.723,平均为0.651.相似系数在0.29~0.94之间,平均值为0.62.聚类分析表明,10对引物可将66份玉米自交系区分开来.初步构建了重庆市66个玉米自交系的指纹图谱.     

Conservation of polymorphic simple sequence loci in cetacean species

Length polymorphisms within simple-sequence loci occur ubiquitously in non-coding eukaryotic DNA and can be highly informative in the analysis of natural populations. Simple-sequence length polymorphisms (SSLP) in the long-finned pilot whale Globicephala melas (Delphinidae) have provided useful information on the mating system as well as on the genetic structure of populations. We have therefore tested whether the polymerase chain reaction primers designed for Globicephala could also be used to uncover variability in other whale species. Homologous loci could indeed be amplified from a diverse range of whales, including all toothed (Odontoceti) and baleen whales (Mysticeti) tested. Cloning and sequencing these loci from 11 different species revealed an unusually high conservation of sequences flanking the simple-sequence stretches, averaging 3.2% difference over 35-40 Myr. This represents the lowest divergence rate for neutral nucleotide positions found for any species group so far and raises the possible need for a re-evaluation of the age of the modern whales. On the other hand, the high conservation of non-coding sequences in whales simplifies the application of SSLP DNA fingerprinting in cetacean species, as primers designed for one species will often uncover variability in other species.     

猴空泡病毒(SV40)PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立检测实验猴及生物制品中猴空泡病毒(SV40)的PCR方法。方法根据SV40-776株设计合成三对引物对现有毒株进行PCR扩增并克隆测序。用这三对引物对56份猴肾、肺、脾及10批脊髓灰质炎疫苗进行检测。结果三对引物均扩增出目的片段;56份猴脏器和10批疫苗SV40检测均为阴性。结论56只恒河猴和10批疫苗中未检测到SV40,所设计的三对引物检测结果准确,均可用于检测。     

淡水鱼类线粒体DNA D-loop基因的引物设计和应用

 线粒体DNA测序已广泛应用于鉴定和区分种类以及解决系统进化关系问题。本文选取已测定的主要淡水鱼类的线粒体DNA D-loop基因序列进行同源性比较,寻找保守序列,利用简并性原则设计一对通用的简并引物。利用设计的引物对广东省珠江流域主要的淡水鱼类线粒体DNA D-loop控制区基因进行扩增,均能获得单一的目的DNA片断,特异性扩增产物大小为1 kb左右。经测序及与GenBank同源序列的比较,证实为包含线粒体控制区全序列的扩增产物。本研究所设计的引物和应用的方法可以快速地同时对多种鱼类进行大规模的遗传背景分析,鉴定某些难于鉴别的近缘物种,为我国鱼类的种类鉴定、地理种群鉴别及种质资源的评估提供重要的工具。