Pyrococcus sp.DNA聚合酶内蛋白子突变体的剪切性质

将含麦芽糖结合蛋白－嗜热菌ＤＮＡ聚合酶内蛋白子基因的ｐＭＩ８４、ｐＭＩ９４、ｐＭＩ９５三个重组突变体质粒转入Ｅ．ｃｏｌｉ２４２６经发酵及ＩＰＴＧ低温诱导表达,直链淀粉糖亲和纯化获得ＭＩ８４（ｓｅｒ１／Ｓｅｒ５３８Ｓｔｏｐ）、ＭＩ９４（Ｓｅｒ１→ＣｙｓＨ１／Ｓｅｒ５３８Ｓｔｏｐ）、ＭＩ９５（Ｓｅｒ１→Ａｌａ１／Ｓｅｒ５３８Ｓｔｏｐ）三种蛋白质前体。研究了ＰＨ温度、巯基试剂对内蛋白子Ｎ末端的剪切影响。     

含内蛋白子融合表达载体的构建与人神经营养因子-3的初步表达

为了构建一个含蛋白质剪接元件的表达载体 ,将 3.38kb的 p Ex Sec 的多克隆位点 (Eco R /Bam H )处插入一个含多个酶切位点的 49bp寡聚核苷酸。然后将 p MYB12 9中 intein- CBD基因片段移插入上述经改造的p Ex Sec I中 ,构建成含内蛋白子的表达载体 p Ex IC。根据人神经营养因子 - 3(h NT- 3)的已知 DNA序列 ,设计含 NdeI/Xho I酶切位点的引物 ,用 PCR法从人全血总 DNA中扩增 h NT- 3,再插入 p Ex IC载体中 ,构建成 p Ex IC- h NT- 3重组质粒。经转化后 ,工程菌 E.coli BL 2 1(DE3) /p Ex IC- h NT- 3在 L B培养基中获得融合表达 ,根据 intein的自剪切原理 ,在还原剂 DTT作用下 ,初步获得了约 14k D的 h NT- 3目的蛋白。     

人尿胰酶抑制剂部分生化性质

用自制人尿胰酶抑制剂（HUTI）,研究了它的部分生物化学性质。经HPLC和凝胶排阻层析表明,纯HUTI的表观分子量与牛血清白蛋白相当,约为66kD。然而,10％SDS－PAGE分析表明,它的分子量约为40kD,这一差异可能与蛋白分子具有高含量 的糖链有关。另外,对HUTI的氨基酸组成、糖含量和抑制类型等亦进行了研究。     

脲对含内蛋白子前体蛋白剪切的影响

研究了含内蛋白子的前体蛋白［麦芽糖结合蛋白－内蛋白子－几丁质酶结合区（ＭＹＢ）］在脲溶液中的分子构象及变性和复性过程中剪切活性与光谱变化的关系。结果表明，剪切活性随脲浓度的增加而逐渐丧失；当脲浓度大于６ｍｏｌ／Ｌ时，活性完全丧失。变性过程中Ａ２８０ｎｍ随变性程度增加而增强，复性后Ａ２８０ｎｍ与天然态Ａ２８０ｎｍ值相近，剪切活性随之恢复。说明构象松散先于剪切活性，可能在重折叠时，构象核化对剪切活性致关重要。     

人胰岛素样生长因子—Ⅰ的基因克隆,融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因。在序列测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃＩ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的２６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度约９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析,免疫学活性呈阳性反应。