ASP—ChIFN-α融合基因的构建及表达

利用PCR技术从宁夏地方三黄肉鸡肝组织中扩增出α干扰素基因,构建成原核重组表达质粒pET-28a/(ChIFN-α从埃希氏菌属大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出L-天(门)冬酰胺酶Ⅱ(L-Asmraginase,ASP)信号肽基因,并与原核重组质粒pET-28a/ChIFN-α连接,构建成分泌型表达重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α将重组质粒经IPTG诱导5 h.用SDS-PAGE分析表达蛋白含量,并用鸡α-干扰素ELISA(Western-blot)试剂盒检测表达的重组蛋白的特异性.结果表明,包涵体型重组质粒pET-28a/ChIFN-α和分泌型重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α在23 kD处均表达出目的蛋白,蛋白含量分别为27%和38%,pET-28a/ASP-ChIFN-α的蛋白表达含量比pET-28a/ChlFN-α的蛋白表达含量要高出11%,表达的重组蛋白具有特异性.实验实现了鸡α-干扰素成熟蛋白基因的高效表达,筛选出了可应用于临床的鸡α-干扰素高效表达菌株BL21(DE3)(pET-28a/ASP-ChIFN-α).     

毕赤酵母表达猪胃蛋白酶的研究

利用已有的猪胃蛋白酶原A cDNA,构建毕赤酵母pPIC3．5K—pA胞内表达载体．经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得2株高表达的重组子,并研究了在不同pH、不同诱导时间、不同起始浓度和甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低．结果表明：在pH7、诱导72h、起始诱导浓度为OD600为2、甲醇诱导浓度为1％时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6．46U／mL．     

重组人甲状旁腺素(rhPTH(1-84))的原核表达及发酵条件初步优化

 甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone,PTH)是治疗骨质疏松症的药物之一.将人工合成全长人PTH(hPTH(1-84))的核苷酸序列插入pThioHis A载体中,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli.),在IPTG的诱导下,成功实现了rhPTH(1-84)的原核表达.通过发酵条件的优化,初步确定1:40接种LB+30%M9盐溶液的发酵培养基,37℃培养至OD600 nm=0.8时,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,诱导8 h的较优发酵程序.     

重组人载脂蛋白AⅠ米兰突变体在酵母中的分泌表达

将重组质粒pPIC9K-apoAⅠ-milano用BglⅡ酶切后转化Pichia pastoris GS115菌株,筛选得到G418高抗性转化子,经甲醇诱导和摇瓶发酵,用SDS-PAGE与Western blot检测上清液,发现有明显的重组人载脂蛋白AⅠ米兰突变体(rAIM)表达,但其分子量比正常蛋白小.对酵母工程菌的摇瓶发酵条件进行优化后,rAIM表达水平得到提高, 约为70 mg/L发酵液,其中正常大小的rAIM所占的比例约为80%.采用冷丙酮沉淀法初步纯化了酵母工程菌发酵液中的rAIM,并验证其有磷脂结合能力.     

锯缘青蟹抗菌肽Scygonadin基因的转录表达特性研究

Scygonadin是从锯缘青蟹生殖系统分离获得的一种抗菌肽,我们用Dot-blot检测了该基因在锯缘青蟹幼体(溞状幼体和大眼幼体)和成体锯缘青蟹(雄性和雌性)的鳃、甲壳、眼、血细胞、肝胰脏、心脏、肌肉、甲壳下皮层、胃和生殖系统等10个不同组织器官中的转录表达情况.结果显示,该基因仅在雄性生殖系统中转录表达.进一步分析该基因在性成熟雄性锯缘青蟹和远洋梭子蟹生殖系统中不同部位(精巢、输精管、贮精囊和射精管)的转录表达情况,结果显示,Scygonadin基因主要在性成熟锯缘青蟹的射精管中转录表达.     

Chi-linker-Glu融合基因双价植物表达载体的构建及其相关鉴定

将木霉几丁质酶基因Chi和β-1,3-葡聚糖酶基因Glu通过8个中性氨基酸连接起来,形成Chi-linker-Glu融合基因．其中编码区基因长2376bp,共编码792个氨基酸和一个终止子．将该融合基因克隆到中间载体pAHC25中,然后将整个ubi-chi-linker-glu-nos表达盒插入用ubi-bar-nos表达盒代替CaMV35S-gus-nos的高效植物表达载体pBI121中,构建了双价抗真菌基因的重组质粒pBIb-CG,并通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草．PCR扩增和PCR-Southern分析证明已将Chi-linker-Glu融合基因整合到烟草基因组中．     

AtPCS1基因的原核表达及多抗血清的制备

利用RT-PCR扩增拟南芥螯合肽合成酶(AtPCS1)基因全序列,构建原核表达载体pET28a-AtPCS1并测序.将该载体转化大肠杆菌BL21,用0.75mmol/LIPTG诱导融合蛋白AtPCS1-His的表达,纯化该融合蛋白.用纯化的融合蛋白免疫小鼠,ELISA法测定抗血清的效价可达1:2000.抗血清与融合蛋白及拟南芥总蛋白的western-blot结果表明:制备的抗血清具有较高的活性和特异性.     

成年大鼠急性脊髓全横断损伤后差异表达蛋白的蛋白组学研究

为进一步阐明脊髓损伤(SCI)的修复机制,对SD成年大鼠进行急性全横断损伤,将损伤前后的大鼠脊髓总蛋白质进行固相pH梯度双向凝胶电泳(2D-PAGE),经考马斯亮蓝染色后,借助PDQuest软件从中找出差异表达蛋白质点.应用基质辅助激光解吸电离串联质谱对差异表达的蛋白质点进行鉴定,成功鉴定出38种蛋白质.其中表达上调的蛋白质有电压依赖的阴离子选择通道蛋白1,α-烯醇酶、硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶3、生长因子受体结合蛋白2等,表达下调的蛋白质有谷氨酰胺合成酶、14-3-3 epsilon、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1、血红蛋白β-1等.鉴定出的差异蛋白多数涉及到神经细胞的增殖、凋亡、应激反应等过程.     

重组盐藻14-3-3蛋白基因的原核表达及分离纯化

根据克隆的杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因.经原核表达、Ni2+亲和层析法纯化,免疫动物制备抗体. 抗体蛋白质印迹分析检测结果表明抗体能特异结合盐藻细胞分子量为29 kD的多肽.