带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

TAT-SOD融合蛋白的跨膜转导性质的研究

探讨了融合蛋白TAT-SOD的跨膜转导特性.实验结果表明:非变性的TAT-SOD也可以不受细胞种类限制,突破质膜屏障,显著提高L02、A375、Hela细胞的胞内SOD的活力;TAT-SOD的这种跨膜转导有明显的浓度、时间依赖关系,随着浓度和时间的增加而增加;在TAT跨膜转导SOD过程中,TAT-SOD首先黏附到细胞膜上,黏附量随TAT-SOD浓度的提高而明显增加,随作用时间的延长虽然也有增加,但是在30 min内迅速达到一个较高的水平,其后增加的趋势极为缓慢.细胞紫外线辐射防护试验表明,320 U/mL的TAT-SOD对细胞的保护率约为野生型SOD的5倍.试验结果说明,TAT-SOD具有明显的跨膜转导能力,可提高SOD的生物利用率.     

酒精对肝细胞损伤的自由基机理研究

为探讨酒精对肝细胞损伤的自由基机理,首先研究酒精对体外培养的L-02肝细胞的增殖和生化指标的影响.实验表明,酒精浓度在100mL·L-1以上时,共培养结束后30h内细胞存活率始终低于50%;当酒精浓度控制在80mL·L-1以下时,细胞恢复过程中存在存活率突降又上升的时间段;当酒精与细胞共培养时间为2、3、4h时,存活率突降又上升的时间段分别为18、12、6h.结果表明,酒精对肝细胞的损伤因浓度和与细胞共培养时间不同而造成化学损伤(即由酒精及其代谢产物本身的毒性直接杀死细胞)和自由基损伤.酒精引起的自由基损伤具有滞后性;随着与细胞共培养时间的延长,自由基攻击的时间会提前,并且所需的酒精浓度会降低.实验结果证实了酒精对肝细胞损伤确实与自由基有重要的关系,也为从清除自由基途径预防和治疗酒精性肝病提供一定的理论依据.     

毕赤酵母表达的人源Cu/Zn SOD的制备及稳定性分析

探讨了毕赤酵母表达人源Cu/Zn SOD的规模制备方法及稳定性研究.实验结果表明,采用45%乙醇复沉淀的方法来沉淀目标蛋白,目标蛋白回收率达88.89%,纯化倍数达到2.03倍,续而采用大孔树脂HPD500吸附的方法,去除了84.90%的色素,纯化倍数达4.60倍,比活为2700U·mg-1.经过纯化之后,将重组蛋白保存在4℃及低浓度、pH为7.8磷酸盐缓冲液条件37d,仍具有76.74%的活性.     

大黄鱼生长激素在毕赤酵母中的优化表达

尝试利用毕赤酵母的表达系统制备大黄鱼生长激素(Pseudoscraena crocea,growth hormone,pcGH).根据酵母偏好密码子设计优化的基因序列,通过化学方法合成pcGH基因,构建表达载体pPICZ A - GH,利用化学转化技术,将该基因整合到巴斯德毕赤酵母X -33菌株染色体上并得以成功表达,...     

Tat短肽跨膜递送作用的研究(Ⅰ)--模型蛋白Tat-GFP在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨Tat短肽的跨膜递送作用,利用DNA重组技术在毕赤酵母表达系统中表达融合蛋白Tat-GFP,通过硫酸铵沉淀、SephadexG-75凝胶色谱和POROS-20HQ离子交换色谱分离纯化该融合蛋白.表达和纯化了分子量约为29kD的融合蛋白Tat-GFP,在经融合蛋白作用的细胞内检测到融合蛋白的存在.这个结果可望为外源性蛋白进行细胞内治疗提供一种新的工具.     

hCuZn-SOD基因的克隆、表达及其产物的初步纯化和表征

为获得hCuZn-SOD基因,根据GenBank中人铜锌超氧化物歧化酶(hCuZn-SOD)基因碱基序列,设计扩增引物,用RT-PCR方法从人的肝细胞中克隆出hCuZn-SODcDNA序列,并将它插入pUCm-T载体中,经过DNA序列测定证实,该片段序列的一个碱基发生突变(与报道基因相比),引起其编码第116个氨基酸由G变为D.采用定向克隆的方法将hCu Zn-SOD的cDNA片段克隆到表达载体pGEX-2T上,构建表达质粒pGEX-SOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3).SDS-PAGE分析证实,经IPTG诱导,融合蛋白GST-SOD获得高效表达.破碎菌体、上清经谷胱甘肽亲和层析初步纯化后,得到纯度达90%的目的蛋白.活性实验表明,GST-SOD具有生物活性.     

应用比浊法测定凝血酶样酶活性

传统常用目测法观察血浆凝固时间来测定凝血酶样酶的活性,因无法微观地检测凝固过程的起始而导致灵敏度低．应用比浊法检测凝血酶样酶活性,以东菱克栓酶为标准凝血酶样酶,在血浆凝固过程中,浊度随时间基本呈直线变化直至浊度变化最终趋于恒定,表明此时血浆已完全凝固．酶活与浊度一时间变化曲线的直线斜率之间存在严格的线性关系．线性范围为０．０５～０．６５ｕ／ｍＬ．结果表明,比浊法是一种改进的凝血酶样酶测活方法．     

大豆分离蛋白酶解过程的研究与产物分析

将大豆蛋白（ＳＰＩ）经过Ａｓｌ．３９８中性蛋白酶水解，可以获得良好溶解性的多肽，氢基酸及ＩＳＳＰＨ等极有利用价值的大豆水解产物．本文探讨大豆分高蛋白经酶水解后产物（ＳＰＨ）的水解度及粘度变化．通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，半微量－凯氏定氮法，Ｇ－２５凝胶过滤，双缩脲法和茚三酮法分析ＳＰＨ的可溶上清液和不溶渣滓中成分变化情况，并探讨了水解大豆蛋白在食品上的应用．因为其在营养上有更多的优点，可以作为功能型食品的原料开发出具有生理活性作用的食品．     

福建老酒中血管紧张素转换酶抑制物质的分离鉴定

福建老酒的样品经在ＴｏｙｏｐｅａｒｌＨＷ４０５凝胶过滤色谱柱分离成包括蛋白质、肽、乙醇和糖类等５个主要组分，其中含肽类物质的第二组分显示出较强的ＡＣＥ抑制活性，该组分经ＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅＨＲ１０／３０进一步分离纯化，获得３个组分．其中的第二及第三组分具有ＡＣＥ抑制活性，其ＩＣ（５０）分别为２．８及８．１μｇＰｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ，而分子量则为１１００和４５０．