啤酒废酵母中RNA和β-(1,3)-D-葡聚糖的综合提取

为实现RNA和β(1,3)-D-葡聚糖的综合提取,通过碱-酶提取法和优化稀碱提取条件,研究了温度、NaOH质量分数对RNA提取的影响.结果表明:温度为100℃,NaOH质量分数为4％时,提取率为7.65％,纯度为70.24％.进一步比较中性蛋白酶和碱性蛋白酶对β-(1,3)-D-葡聚糖提取的影响,发现中性蛋白酶得到的产物较多,纯度较高,实验结果为进一步的工业化生产奠定了基础.     

沉默白细胞介素10基因对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染的影响

为了研究藏猪免疫细胞中IL-10基因表达抑制后对RNA病毒感染及其免疫应答的影响,本实验构建和筛选了抑制猪IL-10基因表达的shRNA干扰分子及其表达载体,并以新型的壳聚糖接枝聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰分子(CS-N-PEI-PEG)通过离子交联法进行分子包装,制备DNA-壳聚糖纳米分子,体外转染藏猪免疫细胞,观察猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)诱导免疫细胞IL-10基因的表达及其增殖感染水平.实验结果表明:与未转染纳米分子或者纳米分子不表达shRNA的空白对照组相比较,shRNA实验组的IL-10基因表达在24～72h内明显抑制(P<0.05),免疫细胞中PRRSV的增殖水平显著下降(P<0.05);同时IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ基因的mRNA水平明显升高(P<0.05).这些提示IL-10的shRNA转染能使免疫细胞的抗感染能力显著增强,甚至可完全抑制PRRSV的复制.     

靶向TTF-1的siRNA腺相关病毒载体组装验证

为了解决靶向TTF-1的siRNA导入肺腺癌细胞的问题,设计了3条靶向NCI-H1975细胞TTF-1基因的siRNA,并将其分别构建到腺相关病毒上.在293细胞中装配病毒,收获病毒原初液后进行超滤浓缩、层析柱纯化,测定病毒滴度.重组病毒感染肺腺癌细胞系NCI-H1975,通过Western-Blot实验检测siRNA效果,利用凋亡实验验证细胞生物学效应.Western-Blot实验测得siRNA有较好的干扰效果,凋亡实验测得肺腺癌细胞NCI-H1975产生了凋亡,从而证明具有感染性的靶向TTF-1的siRNA腺相关病毒载体组装成功.     

Expression and self-assembly of Heterocapsa circularisquama RNA virus-like particles synthesized in Pichia pastoris

Heterocapsa circularisquama RNA virus(HcRNAV) is the first single-stranded RNA virus to be characterized that infects dinoflagellates.The ability of HcRNAV coat protein(HcRNAV CP) to self-assemble into virus-like particles(VLPs) in vitro suggested that heterologous expression was possible,and that the VLPs might be ideal nanocontainers for the targeted delivery of genes and chemicals.In this paper,we report the expression of a codon-optimized HcRNAV 109 CP gene in Pichia pastoris and the production of self-assembled HcRNAV VLPs using large-scale fermentation.The HcRNAV 109 CP gene was synthesized according to the codon preference of P.pastoris and cloned into a pPICZA vector.The recombinant plasmid pPICZA-CPsyns was transformed into P.pastoris by electroporation.The resulting yeast colonies were screened by PCR and analyzed for protein expression by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.After large-scale fermentation,the yield of HcRNAV CPsyns reached approximately 2.5 g L 1 within 4 d.The HcRNAV VLPs were purified using PEG precipitation followed by cesium chloride density gradient ultracentrifugation,and were subsequently analyzed using UV spectrophotometry and transmission electron microscopy.Fluorescence dye-labeled myoglobin was loaded into the cages of the HcRNAV VLPs and the encapsulation was confirmed by fluorescence spectroscopy.The results point to the possible utilization in pharmacology or nanotechnology of HcRNAV VLPs produced by P.pastoris fermentation.     

靶向srGAP家族的串联短发夹RNA表达

为了解析不同srGAP蛋白在神经元发育中的补偿效应,构建了一种同时靶向srGAP家族成员srGAP1~3的串联短发夹RNA表达系统.通过设计,合成多个寡核苷酸,利用微小RNA表达载体构建相应srGAP基因的短发夹RNA表达质粒,并利用蛋白免疫印迹法筛选敲减作用明显的靶向不同srGAP基因的短发夹RNA,然后,将其串联到同一载体而构建成可以同时靶向srGAP家族的短发夹RNA串联重组质粒.结果表明,筛选得到了分别针对srGAP1~3的短发夹RNA J17、J24和J33,并构建出能够同时靶向srGAP1~3基因的串联短发夹RNA J1+2+3.     

六种核酸提取试剂盒对粪样中小鼠肝炎病毒核酸 提取效率的比较

目的 比较六种商品化试剂盒在小鼠粪便中提取小鼠肝炎病毒(MHV)RNA的效率,筛选出效率高、耗时短的核酸提取方法。方法 采集感染MHV小鼠的新鲜粪便样本,分别用液氮研磨法、磁珠匀浆法以及PBS溶解离心法进行处理,通过同一核酸提取试剂盒比较病毒核酸提取效率,明确最佳样本前处理方法;之后,用6种试剂盒进行RNA提取,经反转录后进行TaqMan实时定量PCR检测,以Ct值评价6种试剂盒的提取效率,结合产物测序和血清抗体ELISA结果,筛选MHV的最佳核酸提取方法。结果 对于粪便样本的前处理,液氮研磨法的RNA提取效率显著高于磁珠匀浆法。对于6种试剂盒的提取效果,TIANGEN DP422[总RNA浓度：(549.70±52.38) ng/μL,Ct值：(24.51±0.10)]核酸提取效率最高;TIANGEN SD101[总RNA浓度：(274.13±6.87) ng/μL,Ct值：(2.39±0.017)]和QIAGEN 52904[总RNA浓度：(288.13±15.11) ng/μL,Ct值：(2.40±0.012)]用时最短;XS VRL[总RNA浓度：(348.80±15.85) ng/μL,Ct值：(24.70±0.13)]操作最为方便。结论 粪便样本前处理建议采用液氮研磨法。针对粪便中MHV RNA的提取,TIANGEN DP422提取效率最高,推荐用于小鼠肝炎病毒的分子生物学检测。     

干扰长链非编码RNA Z38表达对鼻咽癌细胞增殖的影响

新型的长链非编码RNA Z38已证实高表达于肿瘤组织,低表达于癌旁组织,属于癌基因,但其功能和作用机制尚需深入分析。研究目的在于探讨稳定干扰长非编码RNA Z38对鼻咽癌细胞HNE1、5-8F功能和机制的影响。采用慢病毒包埋Z38-shRNA转染进人鼻咽癌细胞HNE1与5-8F,用嘌呤霉素筛选出稳定的干扰细胞系,利用相对实时荧光定量的方法检测干扰效率;使用MTT、和平板克隆集落形成实验验证其对HNE1、5-8F细胞增殖的抑制作用;Transwell检测细胞迁移的能力;采用Western Blot检测干扰Z38表达对抑癌因子P~(53)、P~(21)表达水平的影响。结果表明,慢病毒干扰鼻咽癌细胞显著降低了Z38基因表达水平,并且干扰Z38基因表达后使细胞增殖能力、细胞集落形成能力降低,穿过Transwell小室的细胞数降低,抑癌因子P~(53)、P~(21)表达量上调。由此推测,Z38基因可能为鼻咽癌细胞的癌基因之一。