结核分枝杆菌Hsp16.3单克隆抗体的制备及其特性鉴定

制备抗结核分枝杆菌Hsp16.3的单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。将含目的基因的表达载体pProEXHTb-Hsp16.3,通过E.coli DH5α诱导表达,获得含有6譎is的Hsp16.3蛋白,采用Ni-NTA纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化,并用透析方法进行蛋白复性。将复性的蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。将获得的Hsp16.3阳性杂交瘤细胞株分别利用间接ELISA法和Western blot方法进行效价、相对亲和力及特异性的测定。获得了三株Hsp16.3的单克隆抗体,分别命名为3H6F9、1D5E1和4H8G6,其效价分别为1:1?07、1:1?06和1:1?06,相对亲和力分别为0.0001 mg/mL、0.001 mg/mL和0.001 mg/mL,并且无交叉反应性。所获得的结核分枝杆菌Hsp16.3的单克隆抗体效价高、特异性强,为进一步研究Hsp16.3在结核分枝杆菌潜伏感染中的作用提供了有效的工具。     

我国生物医药行业现状与发展趋势

一、我国生物医药行业基本情况 生物制药是把生物工程技术应用到药物制造领域的过程,其中最为主要的是基因工程方法.生物药品是以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织为起始材料,采用生物学工艺或分离纯化技术制备并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活化制剂,包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、血清、血液制品、免役制剂、细胞因子、抗原、单克隆抗体及基因工程产品(DNA重组产品、体外诊断试剂)等.     

抗人骨桥蛋白单克隆抗体制备及其特异性研究

利用RT-PCR技术克隆人骨桥蛋白(hOPN)基因,构建OPN原核表达质粒pET-32a(+)-hOPN,转化BL21菌株,经IPTG诱导表达重组人骨桥蛋白(rhOPN).以纯化的rhOPN为免疫原,免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS1融合.通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得抗人OPN蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,以ELISA、Western blot对抗体特异性进行鉴定.通过竞争抑制试验对单克隆抗体识别抗原位点进行分析.结果共获得2株抗人OPN单克隆抗体,分别命名为8F1和2B5,亚型测定皆为IgG1.通过细胞侵袭抑制试验检测,2株抗人OPN mAb皆能很好地抑制细胞迁移.本研究成功获得了抗人骨桥蛋白的特异性单克隆抗体,为进一步研究OPN蛋白在自身免疫病和肿瘤中的功能提供了重要的工具.     

抗人胃腺癌细胞株AGS单克隆抗体的制备和初步鉴定

用人胃癌细胞株AGS作为抗原免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备抗人胃癌细胞mAb,应用间接ELISA法进行筛选,显微操作法进行亚克隆并用琼脂糖双向免疫扩散法鉴定亚类,免疫化学法检测特异性,获得l株分泌抗AGS细胞株的mAb的杂交瘤(命名为1B4).该杂瘤分泌的mAb与人宫颈癌细胞株Hela、肝癌细胞株HepG2和正常胎儿肺细胞均为阴性反应,而与AGS细胞呈阳性反应.结果表明,该mAb对AGS细胞株具有一定的特异性,可为胃癌相关抗原的筛选研究提供一定的帮助.     

功能化氧化石墨烯的靶向肿瘤成像与光热治疗

整合素α_vβ₃是一种跨膜糖蛋白, 高表达于多种肿瘤细胞表面, 如人恶性胶质瘤(U87-MG). 它能够作为一类肿瘤标志物, 为肿瘤类型的诊断提供依据, 并为肿瘤治疗提供潜在作用靶点. 本文以人恶性胶质瘤细胞(U87-MG)为治疗模型, 利用靶向配体——整合素α_vβ₃单克隆抗体(integrin α_vβ₃ monoclonal antibody), 偶联新型纳米材料——氧化石墨烯(nano-graphene oxide, NGO), 构建成一种新型纳米探针(NGO-mAb-FITC)用于靶向成像及光热治疗. 这种纳米探针具有主动靶向功能, 可识别α_vβ₃阳性表达细胞U87-MG, 但不被α_vβ₃阴性表达的人乳腺癌细胞(MCF-7)摄取. 通过异硫氰酸荧光素(FITC)共价修饰靶向配体, 使纳米探针(NGO-mAb-FITC)获得对肿瘤细胞的靶向成像作用. 同时, 利用氧化石墨烯在808 nm近红外激光照射下的光热转化性能, 使得特异性摄取NGO-mAb-FITC纳米探针的肿瘤细胞内部产生过高热(hyperthermia), 从而诱导肿瘤细胞热损伤及细胞凋亡. 实验结果表明, NGO-mAb-FITC能有效识别靶细胞, 为肿瘤诊断提供依据, 而利用氧化石墨烯的高光热转换性能, 为肿瘤治疗提供新途径, 并有望成为一种有潜力的新型靶向光热转换探针而用于肿瘤的成像诊断与光热治疗.     

长型肌球蛋白轻链激酶4Ig结构域的表达及单克隆抗体的制备

长型肌球蛋白轻链激酶(long myosin light chain kinase,L-MLCK)及其分子内结构域的功能还不清楚.在研究其功能时,特异性抗体是一基本工具,但目前国际上还没有制备成功特异性较好的抗体.为此,我们先在大肠杆菌E.coliBL21中重组表达了鸡L-MLCK的4Ig蛋白片段(MLCK4Ig),蛋白经纯化后作为抗原免疫小鼠.在小鼠血清中检测到特异性抗体的基础上,建立了2株杂交瘤细胞株,获得抗鸡MLCK4Ig的单克隆抗体.该抗体可以特异与鸡L-MLCK和鸡MLCK4Ig反应.本文并对该抗体的特性及应用进行了讨论.结果表明,我们部分解决了L-MLCK的抗体缺乏问题,为研究L-MLCK及MLCK4Ig片段的功能提供了重要工具.     

硝基苯胺单克隆抗体的制备和效果评价

为了测定水中硝基苯胺类化合物,进而开发酶联免疫分析法(EL ISA)快速检测方法,制备了抗硝基苯胺单克隆抗体。以合成的硝基苯胺完全抗原,作为免疫原免疫B a lb/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、筛选和克隆等,得到了抗硝基苯胺单克隆抗体。该抗体亚类为IgG1,制备的单克隆抗体腹水效果评价达10-7,与其他硝基苯胺结构类似物无交叉反应。实验结果表明,用本间接竞争EL ISA方法可以精确地检测不同水样中硝基苯胺残留。     

19-去甲睾酮单克隆抗体的筛选及icELISA 方法的建立

采用细胞融合技术筛选抗19-去甲睾酮(nortestosterone, NT)单克隆抗体(monoclonalantibody, mAb)杂交瘤细胞株, 体内诱性腹水法制备NT mAb, 建立异源性间接竞争ELISA(indirect competitive ELISA, icELISA)标准曲线, 并对其特异性、理化因素的影响和基质效应性进行探讨. 结果表明, 筛选的5 株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水效价为0.64×10⁵~2.56×10⁵, 半数抑制浓度IC₅₀ 为0.55~1.0 ng/mL, 抗体为IgG₁ 亚型, 具k 轻链, 亲和常数K_a 为2.6×10⁹~4.7×10⁹ L/mol. 建立的icELISA 标准曲线在磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中的线性检测范围为0.004~85.8 ng/mL, IC₅₀ 值为0.55 ng/mL, 检测限(limit of detection, LOD)为0.002 ng/mL; 抗体与17a-去甲睾酮的交叉反应率(cross-reactivity, CR)为62%, 与其他化合物无CR. 标准品稀释液中甲醇的最佳含量为10%, 牛尿1:20 倍稀释可消除基质干扰, ELISA方法和液质联用检测(LC-MS/MS)的相关性良好(R²=0.9871).     

小分子物质苏丹红Ⅰ号单克隆抗体特异性分析

在成功制备的苏丹红Ⅰ号单克隆抗体的基础上,分析抗苏丹红Ⅰ号单克隆抗体特异性.应用RT-PCR方法扩增杂交瘤细胞中苏丹红Ⅰ号单克隆抗体重链和轻链可变区基因、测序,联机Kabat库检索分析.非竞争ELISA方法测定单克隆抗体的亲和常数.ELISA法测定抗体的亚类.以苏丹红Ⅰ号为标准,用ELISA竞争抑制法测定与苏丹红Ⅱ号、Ⅲ号、Ⅳ号的交叉反应率.应用计算机辅助分子空间模拟软件,建立合理的抗体可变区空间结构,苏丹红Ⅰ号、Ⅱ号、Ⅲ号、Ⅳ号的空间结构,并进行对接模型建立.苏丹红Ⅰ号单克隆抗体的重链和轻链的可变区基因     

抗人癌胚抗原单克隆抗体的研制及其在免疫组化中的应用

以高纯CEA为抗原,免疫BALB／c小鼠．取其脾细胞和小鼠SP2／0-Ag14骨髓瘤细胞融合．经2次亚克隆。建立3株稳定分泌抗CEA特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。应用经纯化的该单克隆抗体进行了结肠癌组织切片的免疫组织化学实验．结果显示全部3种抗CEA单克隆抗体对结肠癌亚细胞组分均呈现特异性结合。表明已筛选出适于制作癌胚抗原临床诊断试剂盒所需的特异性单克隆抗体。