基因工程血管抑素3A蛋白的分离纯化

在8mol／mL尿素溶液中,以二硫苏糖醇(DTT)为还原剂,对基因工程血管抑素3A包涵体进行溶解实验。结果发现：1．5h后溶解的上清液蛋白浓度达26．2mg／mL。SDS-PAGE电泳扫描结果显示,3A蛋白经过Sephadex G75分离后PAGE电泳纯达到100％,该步收率达85．82％,相对分子质量为10ku。采用分步稀释法对其进行复性,所获复性3A蛋白经MTT法检测表明：3A蛋白浓度为0．1μg／mL时,对内皮细胞的生长抑制率为93．4％。     

重组人截短型IL-6在大肠杆菌DH5α中的高效表达与纯化

为研究重组人截短型白细胞介素6(rhIL-6)工程菌高效表达的影响因素及纯化方法的优化.观察不同培养温度对重组人截短型IL-6工程菌生长密度和IL-6表达的影响;复性蛋白终浓度对复性效率的影响;细菌诱导培养后,经破菌-洗包-溶包初步纯化后,再经柱层析纯化IL-6.其结果为30℃培养后42℃诱导培养5h的IL-6表达效率最高,达32.8%;复性蛋白终浓度在0.5 g/L以下时,蛋白复性效率最佳,比活性为4.42×108 μmol/min*mg-1;进一步柱层析后,IL-6的纯度达96.5%,得率可达46.5%.最后得出培养和纯化工艺简便易行,可获得高纯度、高比活性的截短型rhIL-6的结论.     

重组人内皮抑素层析复性的相关研究

研究了由大肠杆菌表达的重组人内皮抑素(Recombinant human endostatin,rhES)的复性、纯化过程.比较先层析复性后纯化(工艺1)和先纯化后层析复性(工艺2)两种工艺的结果表明:工艺1所得rhES的收率和活性回收率分别为64.44%和213.19%,与工艺2相比分别提高8.70%和33.04%.工艺1中,研究了3种凝胶过滤柱复性及复性pH和上样蛋白浓度对复性的影响,并优化相关工艺.结果表明:在pH9.0,rhES浓度3.91 mg/mL的条件下,采用双梯度凝胶过滤Sephacryl S-100 HR进行层析复性,Sephadex G-25脱盐后,用SP Sepharose FF阳离子交换吸附纯化,获得活性回收率为213.19%,HPLC纯度为97.07%的rhES,其IC50为1.58 ug/mL.     

人P53的原核表达及包涵体复性研究

通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础.     

丙二酸盐克罗诺杆菌PspA包涵体蛋白的表达、复性及纯化方法优化

为研究丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)中噬菌体休克蛋白A(phage shock protein A,PspA)的结构与功能，文章构建了PspA融合蛋白表达载体，但重组蛋白以包涵体形式大量表达；为获取较高浓度的可溶性蛋白进行后续探究，使用尿素裂解液使蛋白变性后，经多种方法复性GST-PspA包涵体蛋白，使其重新恢复生物学活性。研究结果表明，4℃低温条件下包涵体蛋白经尿素梯度稀释透析以控制复性速率，防止蛋白分子快速聚集，可以实现高效复性和纯化GST-PspA融合蛋白。为进一步探索Psp系统中各蛋白的功能及相互作用的研究提供一定的参考。     

重组人TRAIL蛋白的原核表达、纯化及鉴定

将含有人TRAIL蛋白表达质粒的大肠杆菌以IPTG诱导表达 ,表达蛋白主要以包涵体形式存在 .经菌体破碎、包涵体分离、抽提及复性 ,用Ni NTASuperflow柱层析及进一步的离子交换色谱分离纯化获得纯蛋白 .SDS PAGE显示纯化的蛋白为 19kD的单一条带 .Westernblot鉴定表明 ,纯化的表达产物与抗人TRAIL蛋白的抗体发生特异性免疫反应 .抗肿瘤生物活性测定表明该纯化蛋白对肿瘤细胞的体外生长具有显著的抑制作用 .     

我校—高新技术成果问世 变性蛋白复性及同时纯化装置研制成功

我校现代分离科学省级重点实验室主任耿信笃教授等经两年奋战,研制成功变性蛋白复性及同时纯化装置。这项成果可广泛应用于生物技术中各类蛋白的复性纯化及制备,在基因工程生产治疗蛋白药物的下游技术中有着广泛的应用前景,对于基因工程中降低生产成本、改善生产环境均有重要意义。该项目从用色谱纯化蛋白理论研究开始,建立了同时进行变性蛋白复性及纯化操作的新理论,研究了各种分离复性蛋白的机理,提出了如何在分子水平上给变性蛋白提供足够能量,以克服在蛋白复性过程中可能存在的能垒,如何瞬时使变性蛋白分子脱水,如何为蛋白折叠…     

rhFGF-8a制备及其对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响

为研究rhFGF-8a对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成的影响,通过基因工程方法获得了rhFGF-8a包涵体蛋白的大量表达,经复性、纯化后获得纯度高达99%以上的rhFGF-8a蛋白。通过细胞增殖法测定rhFGF-8a的生物学活性,运用鸡胚绒毛尿囊膜实验观察其对新生血管生成的影响,结果表明:纯化后的rhFGF-8a能够刺激小鼠成纤维细胞NIH 3T3的生长;rhFGF-8a诱发鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成能力很弱。     

葡激酶突变体Y1-Sak的体外变复性研究

具有低免疫原性的双功能葡激酶突变体Y1-Sak(△15,S16K,K74A,E75A,R77A,K109R,F111D)在大肠杆菌中的表达产物为包涵体,必须进行体外变复性才能得到活性.详细研究了复性方式、pH、温度、复性的初始蛋白浓度和添加L-精氨酸对Y1-Sak的体外变复性的影响,发现复性温度和添加的L-精氨酸对Y1-Sak的复性有重要的影响.经过工艺优化后,Y1-Sak的纯化活性回收率达到40%左右,蛋白比活性由20 kU/mg提高到53 kU/mg.用动态光散射分析发现,工艺优化后复性的高比活性Y1-Sak的水合动力学半径与野生型葡激酶相近,分子基本处于单体状态.     

马铃薯钾离子通道蛋白SKT1的原核表达与纯化

克隆马铃薯(Solanum tuberosum L.)钾离子通道蛋白SKT1基因片段后原核表达并纯化SKT1蛋白,为进一步研究SKT1的晶体结构与功能,以及与其它钾离子通道蛋白的相互作用奠定基础.以马铃薯试管苗总RNA反转录出的cDNA为模板,PCR扩增SKT1蛋白的胞内区,基因片段为1758bp,构建原核表达载体pET30-SKT1,转化大肠杆菌BL21表达株菌,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE检测发现SKT1蛋白主要是以包涵体的形式存在.利用6M盐酸胍对SKT1包涵体进行溶解,利用Ni柱亲和纯化,最后在复性缓冲液中复性.获得了SKT1蛋白,复性得率大于40%,纯度达到95%以上,Western Blotting鉴定正确.     

PPARγ罗格列酮对HT-29的生长抑制作用

PPARγ配体在抗肿瘤中发挥着重要的作用,这些配体具有抗肿瘤、诱导分化和抗血管生成等效果.目的主要是评估PPARγ激动剂罗格列酮对结肠癌细胞株HT-29生长的抑制作用.结果显示,罗格列酮可以有效地抑制体外培养的结肠癌细胞株HT-29的生长及克隆形成,并能抑制HT-29裸鼠移植瘤的生长.与此同时,罗格列酮能够升高PPARγ, p- PPARγ的表达水平.以上结果初步证明罗格列酮在体内外均可抑制结肠癌细胞株HT-29的成长,提示罗格列酮有可能发展成为治疗结肠癌的有效药物.     

天然气蒸汽转化环状催化剂孔结构的改进

为了提高天然气蒸汽转化环状催化剂的活性,利用开孔剂和成孔剂对传统转化环状催化剂的孔结构进行了改进,优选出开孔剂SJ和成孔剂2A3H。实验结果表明:适宜的SJ粒度为200~300μm,含量为5.0%;成孔剂2A3H的含量为15.0%~18.0%。研制的改进型环状转化催化剂的强度能够满足工业要求,与传统环状转化催化剂相比,在同样的反应条件下高温活性提高27%~30%。     

Tumour biology: herceptin acts as an anti-angiogenic cocktail

Malignant tumours secrete factors that enable them to commandeer their own blood supply (angiogenesis), and blocking the action of these factors can inhibit tumour growth. But because tumours may become resistant to treatments that target individual angiogenic factors by switching over to other angiogenic molecules, a cocktail of multiple anti-angiogenic agents should be more effective. Here we show that herceptin, a monoclonal antibody against the cell-surface receptor HER2 (for human epidermal growth factor receptor-2; ref. 4), induces normalization and regression of the vasculature in an experimental human breast tumour that overexpresses HER2 in mice, and that it works by modulating the effects of different pro- and anti-angiogenic factors. As a single agent that acts against multiple targets, herceptin, or drugs like it, may offer a simple alternative to combination anti-angiogenic treatments.     

φ10启动子控制下大肠杆菌中rhNTA表达的乳糖诱导

采用乳糖作为诱导物,对φ启动子控制下重组蛋白rhNTA（a new thrombolytic agent）在大肠杆菌中的表达进行研究,结果为培养12h（诱导6h）后湿菌体重量86．0－100．2g/L、目标蛋白占细胞总蛋白的40％－50％。研究了关键基质组分、乳糖诱导等对表达的作用。结果表明,基础料和补充氮源中酵母膏的比例、诱导时机和乳糖流加方式等对表达量的提高有明显的影响。实验显示,采用乳糖诱导时重组蛋白的可溶性部分占有较大的比例。     

HSVECs血管生成模型和HUVECs血管生成模型的比较

 首次利用人隐静脉内皮细胞(HSVECs)在体外建立血管生成模型,并与脐静脉内皮细胞(HUVECs)模型进行比较.在不加入任何生长因子的条件下,在三维胶原系统中经过3 d的培养,HSVECs能形成毛细血管样网状结构.genistein是一种酪氨酸酶抑制剂,它能影响毛细血管网的形成.与HUVECs模型比较两者存在明显的差异性.HSVECs在体外三维模型中能形成一种变异型的毛细血管样网状结构.     

不同型抗氟剂对氟暴露工人的排氟效果比较

为了给早期防治氟病进一步优选有效的抗氟剂提供依据，将三个铝厂氟暴露工龄4年以上同类工种的男性工人159名分为A，B两组，对分别服用自制的1，2，3型抗氟剂的A组工人尿氟日排出量与B组进行比较。结果表明：A组工人尿氟日排出量明显高于B组，其效果依次为抗氟剂－3＞抗氟剂－2＞抗氟剂－1，尿氟排出量的增加分别为70．1％，60．8％，45．6％。初步显示，抗氟剂－3和抗氟剂－2的排氟效果较优于抗氟剂－1。     

Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis

Blood vessels deliver oxygen and nutrients to every part of the body, but also nourish diseases such as cancer. Over the past decade, our understanding of the molecular mechanisms of angiogenesis (blood vessel growth) has increased at an explosive rate and has led to the approval of anti-angiogenic drugs for cancer and eye diseases. So far, hundreds of thousands of patients have benefited from blockers of the angiogenic protein vascular endothelial growth factor, but limited efficacy and resistance remain outstanding problems. Recent preclinical and clinical studies have shown new molecular targets and principles, which may provide avenues for improving the therapeutic benefit from anti-angiogenic strategies.     

风味型红枣蜂蜜果冻的研制

以红枣和蜂蜜为主要原料,研制色泽美观、风味独特并具有一定保健功能的果冻。通过正交实验进行红枣蜂蜜果冻的研制。结果表明,最佳生产配方为65％红枣汁、0．8％混合胶[m（琼脂）：m（黄原胶）=1：1]、3％蜂蜜＋0．1％蛋白糖和0．2％柠檬酸。研制的果冻色泽均匀、组织状态良好、风味独特。     

人表皮生长因子融合蛋白在大肠杆菌表达的研究

在大肠杆菌中高效表达人表皮生长因子(hEGF)。根据大肠杆菌对密码的偏爱性,构建高效表达EGF融合蛋白的菌株,经离子交换层析和凝胶过滤层析两个步骤使产物得到纯化。融合蛋白表达产量为27%,EGF融合蛋白纯化产物纯度为95%以上,促3T3细胞增殖的活性测定为ED50为4.2ng/mL。在pET 3c:BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中,以融合蛋白方式表达人表皮生长因子,表达效率高,纯化路线简单,产量较高,适合产业化生产。