乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达

以重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶（L-谷氨酸：氨连接酶，Glutamine Synthetase，GSEC6.3.1.2）蛋白表达宿主菌株BL21（DE3）（pET3C／谷氨酰胺合成酶）作为研究对象，借助SDS-PAGE分析方法，对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究，分别比较了最佳诱导起始生长量、所需乳糖的浓度、诱导持续时间、补加乳糖和氨苄青霉素及不同培养基等参数对重组产物表达的影响．实验结果表明，对于T7lac启动子控制的重组目的产物，乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果，诱导产物的表达量、可溶性及酶活与IPTG诱导产物基本接近．本研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌谷氨酰胺合成酶工业化生产提供了一定的参考依据．     

乳糖诱导pET载体表达重组蛋白的研究

以重组人B淋巴细胞刺激因子（hBLyS）蛋白表达宿主菌株BL21（DE3）（pET30(a)/hBLyS）作为研究对象，借助SDS－PAGE分析方法，对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物的表达规律进行了优化研究。分析比较了诱导的起始阶段、所需的乳糖浓度和诱导持续时间等参数对重组产物表达的影响。实验结果表明，对T7lac启动子控制的重组目的产物，乳糖可以作为诱导剂；在对诱导条件进行优化控制的前提下，乳糖诱导目的产物的绝对表达量虽然不及IPTG，但相对成本却比IPTG低得多。研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组基因工程药物工业化生产提供了一定的参考。     

诱导剂对重组人锰超氧化物歧化酶表达的影响

用异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、乳糖、巯基乙醇对重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD)工程菌进行诱导，结果表明3种物质都可以诱导rhMn-SOD外源蛋白的表述。通过酶活力、比活测定及电泳的结果显示，以乳糖作为诱导剂的表达效果明显好于IPTG和疏基乙醇，进一步的实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度在80mmol/L。     

乳糖诱导mIL-9蛋白高效表达研究

研究了乳糖诱导重组工程菌pET(32a+)-rmIL-9/BL21(DE3)高效表达rmIL-9融合蛋白的实验条件,探讨规模化生产rmIL-9的可行性.分别考察乳糖诱导时机、诱导浓度、诱导时间等参数对rmIL-9融合蛋白表达的影响,并通过正交实验,筛选最佳的乳糖诱导条件.结果显示,对于rmIL-9融合蛋白,乳糖作为诱导剂可达到良好的诱导效果,诱导产物的表达量可优于IPTG诱导产物.最优诱导表达条件为:当菌液OD600值为1时,添加终浓度为5g/L的乳糖,诱导9 h可以高效表达目的蛋白.实验表明,采用乳糖可以诱导rmIL-9融合蛋白基因的高效表达,此为动物实验评价rmIL-9治疗黑色素瘤提供了前期基础.     

人白细胞介素Ⅰ受体拮抗剂工程菌表达

人白细胞介素Ⅰ受体拮抗剂（IL－1ra)工程菌株表达目的蛋白水平受菌体生物量和诱导时间的影响,在生物量A60010 0．15－0．30温度热诱导3h-4h,目的蛋白表达量可达到较高水平。工程菌培养50代以上重组质粒保留90％以上。     

诱导条件对重组人锰超氧化物歧化酶发酵的影响

分别研究了3种诱导剂和Mn^2＋浓度对重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD）发酵表达的影响,并进一步优化了乳糖诱导rhMn-SOD表达的条件。结果表明：异丙基--βD-硫代半乳糖苷（IPTG）和乳糖诱导能够获得类似的表达效果,诱导的同时加入2 mmol/L的Mn^2＋能够明显提高rhMn-SOD的表达。进一步的实验结果表明：乳糖诱导的最佳浓度为7 mmol/L,最佳时机为接种后6 h,A600为2.1,诱导表达6 h rhMn-SOD活性和比活达到最高。     

乳糖诱导方式对降血糖药物表达的影响

对重组E.coli BL21(DE3)表达降血糖药物胰升血糖素样肽-1类似物的乳糖诱导方式进行了研究.结果表明诱导剂乳糖分批添加在生物量与蛋白表达量上均优于一次性添加方式,因为乳糖可被细菌作为碳源利用,分批添加乳糖诱导的目的蛋白表达量高达48.0%.研究结果证明乳糖分批流加可用于高密度发酵表达重组GLP-1类似物,并对其它重组基因工程药物的生产具有指导意义.     

微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化

对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21（DE3）进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和SDS-PAGE电泳分析.结果表明：谷氨酰胺转胺酶在28℃,添加乳糖为1.2g/L诱导18 h,pH为7.0,培养11.5 h时升温至50℃诱导1 h,再放至28℃培养,表达效果较好,超过IPTG诱导效果.纯化后酶活为7.5 U/mL,比活力为10.9 U/mg.     

人免疫缺陷病毒2型（HIV—2）穿膜蛋白基因片段克隆表达

以人免疫缺陷病毒２（ＨＩＶ－２）的原病毒基因组为模板,通过套式ＰＣＲ扩增得到了ＨＩＶ２的一段特异性膜抗原蛋白基因片段;随后将此片段克隆入诱导表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１,获得了重组表达质粒ｐＧＥＸ３６－ＥＮＶ．ＩＰＴＧ对重组表达菌株诱导后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示重组菌株有特异性表达蛋白带产生。     

HCV多表位抗原基因与β-半乳糖苷酶基因融合表达、产物纯化及酶活性分析

设计一个270bp的丙型肝炎病毒（HCV）复合多表位抗原基因（PCX）,与β－半乳糖苷酶（GZ）基因融合后,在高浓度肉汤培养基中,于转接1％量后3．25h,用终浓度为1mmol／LIPTG诱导4h发酵表达,其表达量最高,约占50％总蛋白量,表达产量GZ－PCX以包含体形式存在．利用改良的包含体纯化及溶解方法,可获得溶解率＞90％,纯度为96．2％的产物GZ－PCX,且包含体溶解产物较好保存其蛋白酶活．对PBS／EDTA透析,GZ－PCX蛋白的β－半乳糖苷酶活性可升高4倍,对H2O／EDTA透析其活性则明显下降．     

大肠杆菌工程菌发酵工艺中诱导条件的研究

通过比较在分批发酵中分别加入诱导剂IPTG0．3mM和0．5mM与诱导时间为3h和4h的不同组合,观察其对重组蛋白表达的影响,从而筛选出目的蛋白高效表达的最佳条件．实验表明,工程菌在对数生长的中后期（OD600为4）时添加终浓度为0．5mM的WIG诱导对蛋白的表达最为有利．     

史氏鲟（Acipenser schrenckii）两种促性腺激素β亚基的原核表达

 采用遗传工程方法,重组表达史氏鲟两种促性腺激素β亚基蛋白。选用原核表达载体pET－22b(+),分别插入史氏鲟GtHⅠ&;Ⅱβ亚基成熟肽cDNA序列,构建成C端含有6个组氨酸(6-His)融合蛋白标签的表达质粒;分别转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）并诱导表达2个基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白相对分子质量分别为：GtHⅠβ亚基大约14 000,GtHⅡβ亚基15 000左右。分别用抗6个组氨酸融合标签的单克隆抗体及兔抗鲟鱼GTH多克隆抗体对2个表达蛋白进行Western Blot分析,结果显示重组蛋白表达正确且有较高的免疫活性。GTHⅠβ重组蛋白在2 h就有明显的表达,6 h后随着时间增加表达量不再增加;25 ℃诱导重组蛋白产量比37 ℃诱导产量低。获得的重组蛋白质将可用于建立鲟鱼GtH的放射免疫测定方法。     

大肠杆菌中人心钠素基因在P_L和T7启动子控制下的高效表达

将Ｐ１噬菌体的ｒｅｆ基因与人心钠素的嵌合基因ＲＥＦ－ＡＮＰ分别克隆入带Ｐ＿Ｌ启动子和Ｔ７启动子的两种表达载体，获得高效表达重组质粒ｐＺＪＭ１和ｐＺＪＭ４．ｐＺＪＭ１转化ＤＨ５α、ｐＺＪＭ４转化ＨＭＳ１７４，在表达细菌培养到ＯＤ＿（６００）＝０．２５时分别进行温度诱导和化学诱导，快速凝胶扫描结果表明ＲＥＰ－ＡＮＰ表达量各占细菌可溶性总蛋白的６７．１％和２８．１％；在ＯＤ＿（６００）＝１．０或２．０时进行诱导，均能维持高效表达；且温度诱导的表达效率总是优于化学诱导。     

格列卫对恶性淋巴瘤细胞Raji凋亡和增殖的实验研究

目的研究不同浓度格列卫对恶性淋巴瘤细胞株Raji细胞的影响．方法采用MTT法检测不同浓度格列卫对Raji细胞在不同时间的生长抑制作用,应用流式细胞术检测药物对Raji细胞Caspase-3的表达及G1期、S期占整个细胞周期的比例,采用免疫组化SABC法检测药物对Raji细胞P16蛋白的表达．结果格列卫使细胞存活率明显下降（P〈0．05）;未能上调Caspase-3表达（P〉0．05）;无明显诱导凋亡作用（P〉0．05）;格列卫在低浓度72h与高浓度48h、72h时P16蛋白表达与对照组相比有显著差异（P〈0．05）;格列卫对Raji细胞G1期、S期所占细胞周期的比例与对照组相比无显著差异（P〉0．05）．结论ST1571在高浓度时可以上调Raji细胞P16蛋白的表达;ST1571对恶性淋巴瘤细胞株Raji细胞无上调Caspase-3表达及影响细胞周期的作用．     

重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶蛋白在改良M9培养基中的诱导表达

以重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶(L-谷氨酸:氨连接酶,Glutamine Synthetase, GS EC 6.3.1.2)蛋白表达宿主菌株BL21(DE3) (pET3C/谷氨酰胺合成酶)作为研究对象,借助SDS PAGE分析方法,对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物蛋白的各种基本参数进行了初步的研究.研究了最佳本底培养基、最佳碳源及其最佳添加比例、碳源与诱导物的最适组合,并探索了适用于改良型培养基的诱导参数.实验结果表明,对于重组目的产物蛋白,改良型M9培养基完全可以替代LB培养基;以甘油为碳源,可以避免葡萄糖对T7lac启动子的屏蔽作用.以乳糖为诱导物,目的蛋白的表达量、可溶性及酶活与以IPTG为诱导物基本接近.研究结果为酶法合成谷氨酰胺的工业化生产提供了一定的参考.     

人转化生长因子β1在大肠杆菌RR1中的表达及产物纯化

目的：构建能高效表达人转化生长因子β1的基因工程菌,优化产物分离纯化的条件,方法：用PCR方法扩增人转化生长因子β1的cDNA,将该cDNA片段插入经改造的pBV220表达载体pBL2的表达框架中,构建了表达菌株RR1／pBL－2－TGF－β1．42℃温控诱导表达,采用谷胱甘肽法,对重组蛋白进行复性。通过阳性离子交换、变性分子筛层析纯化重组蛋白,用MTT法测定重组蛋白的活性。结果：所构建的表达菌株,其TGF－β1的表达量约为15％,重组蛋白的复性率达到30％,经纯化获得了银染一条带的重组蛋白,测活表明和理级具有较强的生物活性。结论：人转化生长因子β1在大肠杆菌RR1中实现了高效表达,获得了具有生物活性的重组TGF－β1。     

大肠杆菌中表达外源重组蛋白的研究

通过聚合酶链式反应（PCR），扩增出交链孢菌激活蛋白辅助蛋白基因p42A．并将该基因按正确阅读框克隆到表达载体pGEx—KG中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游。重组质粒转化大肠杆菌BL21，通过建立重组菌生长时间与OD600值的关系，及对菌液密度、诱导剂浓度、诱导时间和温度等条件的摸索，根据SDS—PAGE电泳检测结果判断融合蛋白的最佳表达条件。实验结果表明，最适诱导时期为重组菌生长对数中期；IPTG的最佳浓度为1．0mmol／L：37℃下诱导培养4h时产物表达量最高。超声波破碎菌体细胞，离心及电泳结果表明，表达产物为可溶性蛋白。     

人胎盘催乳素在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法扩增人胎内乳素（ｈＰＬ）ｃＤＮＡ得到５９７ｂｐ的片段,在其两端加上了合适的酶切位点及起始、终止密码子,钭其与高效表达载体ｐＢＶ２２０重组连接,转入大肠杆菌ＤＨ５α,得到稳定遗传的重组质粒转化子ｐＢＶ－ｈＰＬ。ｐＢＶ－ｈＰＬ菌株经热诱导后,有２２ｋＤ的蛋白表达,表达量占菌体总蛋白的１２．９４％,ｈＰＬ表达蛋白以包涵体形式存在,复性处理后,得到有生物活性的成熟蛋白。     

重组融合蛋白GST—SLT—ⅡeB表达条件的研究

通过在不同温度，不同诱导时间，不同异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷诱导浓度条件下，对重组大肠杆菌ＰＰＳＬＴ－ⅡｅＢ表达的谷胱甘肽－Ｓ－转移酶与类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体Ｂ亚单位的融合蛋白（ＧＳＴ－ＳＬＴ－ⅡｅＢ）的条件，结果表明：在所试条件中，温度是影响表达的主要因素，重组大肠杆菌在２８℃温度条件下，可以明显表达融合蛋白ＧＳＴ－ＳＬＴ－ⅡｅＢ，在ＩＰＴＧ为１ｍｍｏｌ．Ｌ＾－１浓度条件下，２ｈ的诱导即可获     

人血管生成抑制素基因在大肠杆菌中的融合表达

将人血管生成抑制素基因定向插入表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的ＢａｍＨⅠ位点,构建重组质粒ｐＥＴＡ２,转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）．在ＩＰＴＧ诱导下,血管生成抑制素基因在重组转化株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３,ｐＥＴＡ２）中获得高效表达．表达产物以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的３７．２％．利用羊抗人纤溶酶原抗血清作为第一抗体,免疫印迹分析证明表达产物具有特异的免疫原性