大黄鱼trim38基因的克隆及其表达分析

］由变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）引起的大黄鱼（Larimichthys crocea）内脏白点病的死亡率可达50%~80%。对抗病相关基因trim38进行了分子及表达特征等分析。结果显示:该基因开放阅读框（ORF）1623 bp，编码540个氨基酸，预测蛋白分子量为61.58 ku，等电点6.99。qRT-PCR的结果表明，在所有检测的组织中都发现了trim38的转录产物，但在肾脏中的相对表达量最高。变形假单胞菌攻毒刺激后，大黄鱼脾脏中该基因持续表达，在120 h达到峰值；肝脏中3 h显著表达，之后相对表达量降低；肾脏中该基因相对表达量变化不大，在96 h左右达到最大值。上述结果表明trim38基因参与了大黄鱼应对变形假单胞菌感染的抗病免疫过程。     

大黄鱼人工感染杀香鱼假单胞菌的病理形态学及病原分布的初步研究

为了研究杀香鱼假单胞菌在感染大黄鱼体内的分布状况及其所致各器官的病理损伤特点,通过人工回感试验,利用组织切片及免疫组化技术对感染大黄鱼的肝脏、脾脏、肾脏及鳃组织进行了组织病理切片,并进行HE染色和免疫组化分析。结果显示,人工感染发病大黄鱼临床症状与自然感染发病症状一致,病鱼体表无明显病症,但肝、脾、肾等内脏有大量白色结节;组织病理显示,病鱼肝脏、脾脏和肾脏是感染损伤的主要靶器官,内脏组织发生变性、坏死以及出现特征性的病理性结节;免疫组化检测特异性阳性信号出现在病鱼内脏组织器官的血窦或血管以及巨噬细胞内。研究表明,杀香鱼假单胞菌侵入鱼体后,主要分布在机体的血液中并大量增殖,通过血液循环到达鱼体各内脏器官;杀香鱼假单胞菌在鱼组织内的分布与其所致病理损伤之间呈正相关。     

用PCR方法检测土壤中类鼻疽假单胞菌的研究

目的建立一种灵敏、特异的检测土壤中类鼻疽假单胞菌的聚合酶链反应(PCR)方法.方法用类鼻疽假单胞菌鞭毛蛋白的基因作引物,用PCR扩增的方法检测6种土壤中不同浓度的类鼻疽假单胞菌和3个假单胞菌属的3种对照菌.结果用鞭毛蛋白基因作引物的PCR方法具有高灵敏度,其他3种对照结果阴性.结论用类鼻疽假单胞菌鞭毛蛋白基因作引物建立的PCR方法为检测土壤中类鼻疽假单胞菌提供了科学依据.     

大黄鱼Rnd1基因表达载体构建及表达模式分析

为探究Rnd1基因在大黄鱼免疫应答过程中的作用,采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）对该基因的表达模式进行分析,同时构建原核表达载体pET-28a-Rnd1,并转化进大肠杆菌后诱导该蛋白的融合表达。研究结果表明:大黄鱼Rnd1基因ORF为699 bp,编码232个氨基酸;经序列多重比对和进化树构建发现,Rnd1的氨基酸序列高度保守;在健康大黄鱼的8个免疫组织中,Rnd1在肝脏中相对表达量最高,其次为脑,而在肠中表达量最低;变形假单胞菌攻毒后,Rnd1在肝脏中48 h时达到最高值,为对照组的25倍;在脾脏中则持续上调表达,尤其在48 h后升高更为明显。     

实时荧光定量PCR法检测环境假单胞菌属细菌丰度

应用实时荧光定量PCR法,建立了总细菌及假单胞菌属的标准曲线,并以环境样本中假单胞菌属与总细菌的比值反映其细菌丰度.应用该方法评价人工除藻反应器中组合填料、无纺布、弹性填料等介质对太湖水中溶藻细菌之一的假单胞菌属的富集情况.结果显示:该方法对总细菌的检测范围为103~108个基因拷贝/μL(R2=0.997);假单胞菌属的检测范围为1~105个基因拷贝/μL(R2=0.994).对除藻反应器溶藻细菌富集效果的评价显示,所建立的方法能有效检测反应器中填料对该类溶藻细菌的富集程度.初步证明所建立的方法可有效定量假单胞菌属在环境样本中的丰度.     

温度对大黄鱼源变形假单胞菌胞外产物酶活力的影响

为了研究大黄鱼源变形假单胞菌胞外产物的致病性,在内脏白点病的高发温度（18 ℃）培养大黄鱼的病原菌——变形假单胞菌,利用玻璃纸覆盖平板技术制备其胞外产物,测定不同温度（低温不致病温度12 ℃、高发致病温度18 ℃和高温不致病温度28 ℃）下其胞外产物的酶活力.结果显示:变形假单胞菌胞外产物的淀粉酶、丝氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类、类胃蛋白酶、类糜蛋白酶、卵磷脂酶、酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶的活性受温度影响比较大,28 ℃条件下酶活力显著（P＜0.05）高于12 ℃或者18 ℃时的酶活力;半胱氨酸蛋白酶类、氨肽酶的活性和溶血活性受温度影响没有显著性变化（P＞0.05）.实验结果表明,虽然变形假单胞菌胞外产物是其致病因素之一,但大黄鱼内脏白点病在特定温度（16~20 ℃）下高发并非是由于胞外产物在该温度下的活性较高.该结果增进了对大黄鱼内脏白点病发病机理的认识.     

沼泽红假单胞菌对小鼠免疫功能影响的试验研究

为探讨沼泽红假单胞菌对动物免疫功能的影响,采用不同菌液浓度的沼泽红假单胞菌饲喂小鼠,检测小鼠免疫器官(脾脏和胸腺)实质重量、巨噬细胞吞噬能力、外周血淋巴细胞转化率以及肠黏膜SIgA等指标,分析沼泽红假单胞菌对试验小鼠免疫功能的影响.结果显示,饲喂沼泽红假单胞菌可促进小鼠的体重增长,脾脏和胸腺的重量增加(P0.05);促进机体巨噬细胞吞噬率、淋巴细胞转化率以及肠黏膜SIgA的变化(P0.05).结论:采用沼泽红假单胞菌饲喂小鼠可提高其机体的免疫能力.     

实时荧光定量RT—PCR检测糖皮质激素α-受体mRNA表达水平方法的建立

建立用荧光定量RT-PCR的方法检测人糖皮质激素α-受体(GR-α)mRNA水平的标准曲线.根据人糖皮质激素α-受体mRNA序列(GeneBank No. NM_000176)设计引物,反转录出cDNA,再插入到PMD18-T载体中.再根据cDNA设计引物和探针,采用TaqMan探针荧光定量RT-PcR的检测方法,构建人GR-α基因表达量的标准曲线.由PMD18-T-GR-α所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×101-1×105拷贝数的人GR-α基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈较好的线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠.     

双重PCR法快速检测欧鳗鲡嗜水气单胞菌

采用已知的嗜水气单胞菌编码溶血素(Hemolysin)和外膜蛋白(Ompts)的基因序列为目的基因,依据其保守序列设计两对相应引物,用双重PCR方法检测了32株从发病欧鳗鲡分离的细菌,将检测结果与试剂盒快速生化鉴定结果进行比较.以嗜水气单胞菌为阳性对照,以大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、鳗弧菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌为阴性对照检测了嗜水气单胞菌溶血素与外膜蛋白基因的特异性.结果表明:被检测的32株欧鳗鲡致病菌中,检测到的4株既有溶血素基因又有外膜蛋白基因的细菌,其生化鉴定结果全部为嗜水气单胞菌,而仅具有外膜蛋白基因的13株细菌中只有5株生化鉴定结果为嗜水气单胞菌.证明双重PCR法可用于快速检测部分嗜水气单胞菌.     

SPF级实验小鼠4种致病菌多重PCR方法的建立及优化

目的 建立一种可同时检测4种SPF级屏障环境常见致病菌的多重PCR方法。方法 本研究针对鼠伤寒沙门氏菌invA基因、肺炎克雷伯杆菌khe基因、嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因、铜绿假单胞菌ecfX基因序列分别设计合成特异性引物,构建可同时鉴别4种菌的多重PCR反应体系,优化后测定其特异性、灵敏性并人工模拟感染样本。结果 建立的4重PCR方法能对同一样品中的4种致病菌模板进行特异性扩增,无交叉反应;对4种目的菌的检测灵敏度为10-3ng/μL;也可从混合感染的病料中特异性地检测出4种致病菌。结论 本试验建立的多重PCR方法具有快速、简便、灵敏的特点,为4种致病菌的快速诊断和监控提供了有效的技术支持。     

铜绿假单胞菌中丙氨酸消旋酶的酶学特性及菌株检测

铜绿假单胞菌为条件致病菌,是目前各种医院内感染最广泛、最严重的致病菌之一.以分离自公共场所洗手液的菌株6-3为研究对象,其16S rRNA基因与Pseudomonas aeruginosa DSM 50071的16S rRNA基因的一致性为99.8%,初步确定其为铜绿假单胞菌;根据同源蛋白的核苷酸序列设计菌株6-3中丙氨酸消旋酶的扩增引物,通过PCR从6-3菌株中克隆获得了丙氨酸消旋酶基因(alrPa),基因序列与P. aeruginosa PAO1中丙氨酸消旋酶Alr_(PAO1)的氨基酸同源率为98.9%,存在4个不一致的氨基酸位点;经原核表达、Ni-NTA亲和层析法纯化获得了蛋白PaAlr,酶学特性分析表明,重组蛋白PaAlr的最适反应温度为40℃,最适反应pH=10.0;最适底物是L-Ala,具有严格的底物特异性,K_(m,L-Ala)=10.96mmol/L,V_(max,L-Ala)=1 562μmol/(L·min),K_(m,D-Ala)=8.45mmol/L,V_(max,D-Ala)=881.9μmol/(L·min),其最大反应速率约为Alr_(PAO1)的7倍;以铜绿假单胞菌中丙氨酸消旋酶为检测对象,以PCR和Western-blotting 2种方法对铜绿假单胞菌进行检测,实验发现,在目的基因序列已知的前提下,采用PCR法具有较好的检测灵敏性和专一性.     

铜绿假单胞菌PA0057基因的克隆、表达及其重组蛋白活性的初步研究

铜绿假单胞菌PA0057基因为Ⅳ类未知基因,通过NCBI比对,发现PA0057基因编码的蛋白与金属β-内酰胺酶同源性为96%,因此推测PA0057蛋白可能具有金属β内酰胺酶活性.提取铜绿假单胞菌PAOI基因组DNA,利用设计的引物通过PCR方法扩增得到PA0057基因,将其克隆至克隆载体pGEM-T,并转化人大肠杆菌DH5α;而后将其克隆至表达载体pET28a中,转化人大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,并通过Ni-NTA亲和柱进行纯化,纯化后蛋白超滤浓缩得高浓度蛋白;通过药敏纸片检测PA0057蛋白活性.     

铜绿假单胞菌PA0057基因的克隆、表达及其重组蛋白活性的初步研究

铜绿假单胞菌PA0057基因为Ⅳ类未知基因,通过NCBI比对,发现PA0057基因编码的蛋白与金属β-内酰胺酶同源性为96%,因此推测PA0057蛋白可能具有金属β内酰胺酶活性.提取铜绿假单胞菌PAOI基因组DNA,利用设计的引物通过PCR方法扩增得到PA0057基因,将其克隆至克隆载体pGEM-T,并转化人大肠杆菌DH5α;而后将其克隆至表达载体pET28a中,转化人大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,并通过Ni-NTA亲和柱进行纯化,纯化后蛋白超滤浓缩得高浓度蛋白;通过药敏纸片检测PA0057蛋白活性.     

废水处理功能菌株FA-2的实时荧光定量PCR检测

FA-2是油脂化工废水处理系统中分离到的降解脂肪酸和脂肪胺的功能菌.本研究以大肠杆菌为参照菌,基于荧光定量PCR技术,建立了检测FA-2相对含量的荧光定量PCR方法.根据FA-2已知特异序列GENE2和大肠杆菌16 s rRNA基因序列GENE1分别设计合成特异引物和Tagman探针,采用实时荧光定量PCR技术分别检测各样本FA-2和E.coli 16 s rRNA基因的相对拷贝数,获得了FA-2及大肠杆菌的标准曲线.并比较这两种基因剂量之比例和混和的菌数比例之间的关系.结果表明混合菌液中FA-2的含量与CtGENE2与CtGENE1的差值ΔCt呈线性关系,由此可以推算出模板DNA的数量及对应的细菌数量.荧光定量检测结果与直接计数结果基本一致.该方法的建立,为进一步在废水处理系统中应用FQ-CR检测功能菌的含量打下基础.     

铜绿假单胞菌下呼吸道感染的临床分析

目的 :分析和总结铜绿假单胞菌下呼吸道感染的临床特点及抗生素敏感性的分布情况。方法 :对 2 8例铜绿假单胞菌下呼吸道感染的临床资料进行综合分析 ,采用纸片法 (Kirby- Bauer)测定该菌的体外药物敏感性。结果 :2 8例患者均有基础肺部疾病 ,其中以慢性支气管炎最常见。临床上表现为发热、咳嗽、咳痰 ,脑部 X线表现为双肺淡薄、斑片状阻影。药敏试验表明 ,铜绿假单胞菌对头孢他啶、头孢哌酮耐药率增加。结论 :铜绿假单胞菌下呼吸道感染多发生在患有各种基础疾病 ,尤其是肺部疾病患者 ,临床表现无特异性 ,耐药率有增加趋势。     

大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定

目的:建立一种快速、准确的大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定方法.方法:根据GenBank中大黄鱼、小黄鱼线粒体中ND6基因的序列,设计并合成特异性引物和cycling探针,以草鱼为阴性对照,进行实时荧光PCR反应.结果:利用设计合成的大黄鱼和小黄鱼特异性引物和cycling探针进行实时荧光PCR反应,大黄鱼和小黄鱼均产生特异扩增曲线,对照的草鱼没有产生扩增曲线.结论:利用设计的引物和cycling探针,可准确快速鉴定大黄鱼和小黄鱼.     

乳粉中常见致病菌的多重荧光PCR检测

利用多重荧光PCR技术快速检测乳粉中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌.以沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因为靶基因,选择特异性引物,以参照菌种为对象,验证引物的特异性,建立多重荧光PCR检测方法,人工添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌,确定方法的检出限.结果表明该方法特异性强、灵敏度高,乳粉中检测的灵敏度为1CFU/mL,可在8h内完成对乳品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的检测.     

大黄鱼Hepcidin基因转录物的相对定量分析

以大黄鱼(Pseudosciaena crocea)管家基因18S rRNA和β-actin作为内参基因,分别比较2个内参基因建立的相对定量曲线,最终确立以18S rRNA为参比基因,定量分析大黄鱼的Hepcidin抗菌肽基因.该相对定量分析方法所得结果与Northern-blot方法一致.应用建立的Hepcidin基因的实时荧光相对定量研究方法,对大黄鱼头肾中的Hepcidin基因转录物进行相对定量,为今后开展鱼体内免疫相关基因的表达特性、诱导机制等工作奠定研究基础.同时,克隆得到的大黄鱼β-actin基因和18S rRNA基因片段已提交基因库,并获得登录号.     

大黄鱼源杀香鱼假单胞菌外膜蛋白OmpA的原核表达及免疫原性分析

外膜蛋白A(OmpA)是革兰氏阴性菌主要的外膜蛋白之一,在多种致病菌中表现出较强的免疫原性,是具有潜力的候选疫苗。为分析大黄鱼内脏白点病病原杀香鱼假单胞菌OmpA类外膜蛋白的免疫原性,本研究选取了杀香鱼假单胞菌基因组中存在的3个OmpA类重组蛋白(依次命名为P1,P2,P5,Genbank收录号分别为EPB94769.1,EPB94930.1,EPB95835.1),通过构建pET30a-OmpA表达载体、转化BL21诱导表达、His标签纯化等技术,获得3个纯化的OmpA类重组蛋白,分子量大小依次为25 kD(P1),32 kD(P2),35 kD(P5)。用制备的新西兰兔抗杀香鱼假单胞菌多克隆抗体,对获得的纯蛋白进行免疫原性Western Blot检测,结果表明:重组蛋白P1,P2,P5均能与兔抗发生特异结合,结合强度P5P2P1。本研究首次获得了杀香鱼假单胞菌OmpA重组蛋白并初步鉴定了其免疫原性,为杀香鱼假单胞菌的疫苗设计和筛选提供了有益参考。