鲍鱼肌原纤维结合型蛋白酶的初步鉴定

研究了皱纹盘鲍腹足肌肉中肌原纤维结合型蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用.SDS-PAGE结果显示,肌原纤维在55~60℃下,肌球蛋白重链(Myosin Heavy Chain,MHC)和副肌球蛋白(Paramyosin,PM)会发生明显的降解.金属蛋白酶抑制剂EDTA、1,10-phenathroline能够有效抑制MHC和PM的分解.EDTA以及丝氨酸蛋白酶抑制剂benzamidine共同作用几乎可完全抑制蛋白质降解,揭示鲍鱼肌肉中存在肌原纤维结合型金属蛋白酶(Metalloproteinase,MP)和丝氨酸蛋白酶(Serine proteinase,SP).通过加热、强离子浓度溶液抽提相结合的方式,从肌原纤维蛋白中初步分离出这两种酶.分别利用这两种酶对肌原纤维蛋白进行降解,发现最适温度均在60℃左右,与肌原纤维蛋白自身降解的最适温度(55~60℃)相吻合.对SP的底物特异性分析结果表明,制备的丝氨酸蛋白酶对P1位为Arg残基的荧光底物有较高的分解作用,而对P1位为Lys残基的底物分解较弱.     

鲤鱼肌肉中胶原蛋白酶的分离纯化与性质分析

利用明胶酶谱法,在鲤鱼肌肉中检测到了一种具有分解胶原蛋白能力的丝氨酸蛋白酶.通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel和Phenyl-Sepharose等一系列柱层析法,纯化得到了分子质量为70 ku,能够降解胶原蛋白的丝氨酸蛋白酶(Collagenolytic Serine Proteinase,CSP).性质分析表明,CSP在弱碱性条件下显示活性,最适温度为30℃;丝氨酸蛋白酶抑制剂特异抑制CSP的活性.CSP能有效地分解鲤鱼肌肉中的I型胶原蛋白,提示其可能在鱼体死后肌肉胶原蛋白降解中发挥着重要的作用.     

酸/碱溶解-等电点沉淀法回收罗非鱼蛋白的工艺优化及蛋白组成分析

以罗非鱼(Oreochromis niloticus)肉为原料,采用酸/碱溶解-等电点沉淀法回收罗非鱼肌肉蛋白,主要探讨溶解p H值、料液比和溶解时间对可溶性蛋白得率以及沉淀p H值对可溶性蛋白沉淀得率及蛋白亚基组成的影响.结果表明,酸/碱溶解回收罗非鱼肉可溶性蛋白的最佳p H值为p H2.0、3.0、11.0和12.0,料液比1∶9(ω/v),溶解时间10 min,可溶性蛋白种类齐全,包含了典型的鱼蛋白电泳条带;酸/碱可溶性蛋白的最佳沉淀条件为p H 5.5,在此条件下,溶解-沉淀过程的蛋白得率分别为61.59%-64.95%.与鱼肉蛋白相比,四种分离蛋白中盐溶性蛋白的比例均升高,水溶性蛋白的比例均降低(p0.05).比较而言,碱溶-等电点沉淀过程中鱼蛋白的变性程度较小,其水溶性组分和盐溶性组分所占的比例均较高,组成相对比较齐全,而酸提蛋白中肌球蛋白重链部分降解,少量肌浆蛋白损失.因此,碱溶-等电点沉淀法更有利于回收鱼肉分离蛋白.     

驴精子顶体蛋白酶的提纯及其一些性质的研究

顶体蛋白酶acrosin(EC3、4、21、10)是存在于哺乳动物精子顶体中的一种丝氨酸蛋白酶,生化性质上属于水溶性碱性糖蛋白,专一水解精氨酰键,最适pH为8.0—8.5。首先在兔精子中提取了顶体蛋白酶,发现此酶能分解兔卵透明带,并且被胰蛋白酶抑制剂所抑     

草鱼胰蛋白酶的分离纯化及性质研究

从草鱼肝胰脏中分离纯化出一种胰蛋白酶．纯化过程包括：硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sephamse离子交换,Sephacryl S-200凝胶过滤和Q-Sepharose离子交换层析．SDS-PAGE显示在分子量约为28．5ku处有单一电泳带,表明该酶已得到高度纯化．以Boc-Leu-Arg-Arg-MCA为底物测得该酶的最适温度为40℃．最适pH值为9．0．丝氨酸蛋白酶抑制剂（Pefabloc SC,PMSF,Benzamidine）对该酶的活力有明显抑制作用．底物特异性实验表明该酶特异性分解精氨酸和赖氨酸残基的C末端,进一步证明纯化蛋白为草鱼胰蛋白酶,其酶学性质与鲤鱼胰蛋白酶相似．     

南美白对虾丝氨酸蛋白酶的分离纯化及性质研究

通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose、Phenyl-Sepharose、Hydroxyapatite、Superdex 75等方法,从南美白对虾消化腺中分离得到一种丝氨酸蛋白酶.SDS-PAGE结果显示,其分子质量约为28 ku,最适pH值与最适温度分别为9.0和40℃,且pH值在7.0~10.0之间以及温度在40℃以下有较高的稳定性.底物特异性实验与抑制剂实验结果表明,该酶属于类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶.动力学实验显示,以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物时,Km=0.69μmol/L,Kcat=0.33 S-1,Kcat/Km=4.78×105(mol/L)-1S-1.     

Alcalase蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究

研究了Alcalase蛋白酶对大豆分离蛋白的水解作用,分析了pH、温度、酶浓度、底物浓度和水解时间对大豆分离蛋白酶解的影响,通过单因素分析、正交试验,确定了Alcalase蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳水解条件,即pH8.0,温度60℃,酶浓度1000U/g,底物浓度3%,水解时间2h.     

鸡肉蛋白水解液的研究

用酶水解鸡肉 ,通过单因素实验确定胰蛋白酶 1、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶 2、胃蛋白酶水解鸡肉的最适条件 ,并确定在它们的最适条件下 ,胰蛋白酶和木瓜蛋白酶是单酶水解较好的酶。在双酶水解中 ,发现胰蛋白酶 1与酸性蛋白酶在各自最适条件下组合水解鸡肉水解率最高 ,进一步确定双酶水解的条件为胰蛋白酶先在 5 0℃ ,p H8.5 ,加酶量 40 0 0 U/ g蛋白质 ,固液比 1∶ 4,水解 3h,后酸性蛋白酶在 45℃ ,p H2 .5 ,加酶量 40 0 0 U/ g蛋白质水解 2 h。在这种组合下酶解 ,水解产物的水解度为 40 .5 % ,蛋白回收率为 81.0 %     

pH渐变条件下双酶协同水解大豆蛋白

研究了在没有外加碱的pH渐变条件下．用枯草杆菌碱性蛋白酶(Alcalase 2．4L,酶活力2．4AU/g)和黑曲霉酸性蛋白酶(酶活力3000u／g)双酶协同水解从大豆蛋白制备寡肽(10个氨基酸以下的肽)水解物的可行性．考察了单酶单因素水解条件、双酶加入方式对大豆蛋白降解率和蛋白质水解度的影响,并在此基础上通过正交试验进一步优化出双酶一次性投料方案下水解大豆蛋白的最佳条件：水解温度为60℃．碱性蛋白酶加入量为每g蛋白15μL,酸性蛋白酶加入量为6％,底物浓度为40g／L,水解时间为18h．在上述最佳条件下,大豆蛋白的降解率可达76％,蛋白质的水解度可达26％,水解物中相对分子质量小于1350的寡肽达到了66％．结果表明,在不外加碱的条件下,采用双酶协同水解方法能够显著提高大豆蛋白降解率以及蛋白质水解度．     

Kunitz抑制剂家族成员抑肽酶对纤溶酶原活化的抑制作用

抑肽酶属Kunitz抑制剂家族成员，能够抑制激肽释放酶、纤溶酶及胰蛋白酶的蛋白水解活性．研究表明，抑肽酶能够抑制尿激酶型-纤溶酶原激活刹（u—PA）和组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）对纤溶酶原的激活，但不影响u—PA和t—PA对小分子底物的酰胺水解活性．用u—PA研究了上述作用的机制，发现抑肽酶与u—PA的丝氨酸蛋白酶功能区特异性结合，而与纤溶酶原没有相互作用．抑肽酶与uPA的结合并不阻断u—PA的活性位点，因为u—PA对小分子底物的水解活性仍然保持．上述发现提示抑肽酶可能存在另一种抑制作用模式，该模式不同于以前报道的关于Kunitz抑制剂或纤溶酶原激活酶抑制剂的作用．由于人体内的Kunitz抑制剂与抑肽酶在结构上非常相似，根据研究结果，推测体内纤溶酶原的激活作用并非仅受丝氨酸蛋白酶抑制剂的控制。     

虎斑颈槽蛇大陆亚种颈背腺体毒液中金属蛋白酶RT-2组分的分离及其性质测定

通过离子交换和凝胶过滤层析的方法,从虎斑颈槽蛇大陆亚种(Rhabdophis tigrinus lateralis)颈背腺体毒液中分离纯化得到一金属蛋白酶RT-2组分,SDS-PAGE电泳显示为单一条带,分子量为81kDa.以酪蛋白为底物测得其蛋白质水解酶比活力为0.56 U/mg,最适作用温度为40 ℃,最适pH为8;Ca2 和Zn2 对其活性有增强作用;EDTA,EGTA,β-巯基乙醇对酶活力有明显的抑制作用,而PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂)对酶活力的影响相对较小; RT-2组分无磷脂酶A、5'核甘酸酶、碱性磷酸单酯酶和磷酸二酯酶活性;也无水解纤维蛋白(原)活性和凝血活性;RT-2组分不诱导小鼠皮下出血.     

蛋白酶水解骨素的对比及其优化研究

选取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶分别对骨素进行酶解,对比了几种酶解液的苦味和水解度.结果表明:风味蛋白酶最适合酶解骨蛋白,其水解产物鲜味明显,无明显苦味;木瓜蛋白酶水解骨蛋白效果最差,其水解产物苦味最为明显;中性蛋白酶水解效果介于风味蛋白酶和木瓜蛋白酶之间.风味蛋白酶水解骨蛋白的最佳酶解条件为:温度50℃,加酶量6 000 U/g底物蛋白,p H值为7.0,酶解时间2 h,料液比1∶5(g/m L),在此条件下其水解度可达34.80%.     

酶法水解乳清蛋白过程的优化

以浓缩乳清蛋白为原料，选择碱性蛋白酶（Alcalase）水解乳清蛋白。分析了pH、温度、酶和底物比（E／S）和反应时间等因素对乳清蛋白水解的影响。通过响应面法分析，确定了碱性蛋白酶（Alcalase）酶解乳清蛋白的最佳水解条件为：pH8．5、反应温度55℃、酶和底物比0．05。水解3．0h，水解度为19．34％。     

酶法制备鸡骨HAP的研究

采用不同蛋白酶对鸡骨进行水解制备动物水解蛋白(HAP).结果表明,胰酶、AS.1398中性蛋白酶和Alcalase具有较好的水解效果.通过正交试验,以水解度为指标确定胰酶的优化水解条件为:温度50℃,pH值8.5,酶和底物的比值(E/S)为0.75%,底物浓度5%,水解时间为60 min;AS.1398中性蛋白酶最适水解条件为:温度55℃,pH值7.5,E/S为3%,底物浓度5%,水解时间为60 min;Alcalase酶解的最适水解条件为:温度60℃,pH值8.5,E/S为1%,底物浓度5%,水解时间为60 min.     

乳清蛋白肽的酶法制备、分离纯化及活性评价

以抗氧化活性及蛋白质回收率为筛选指标对乳清蛋白肽酶解工艺进行优化,用层析柱对酶解液进行逐级分离纯化,并对其分子质量进行检测.研究结果表明:利用胰酶、复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解制备乳清蛋白肽,最佳用酶为碱性蛋白酶、最适底物含量为4.0%、最适加酶量为8000U/g、最佳酶解时间为4h;酶解液经DEAE-52纤维素层析后得到的A组分抗氧化活性最好,其还原力为0.320 0±0.004 1,DPPH自由基清除率为6.58%±0.36%;A组分再经Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱分离纯化后得到组分G,其DPPH自由基清除率为6.73%±0.083%;组分G的主要成分为分子质量378 u的肽段,其一级氨基酸组成为赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)及丝氨酸(Ser).     

Alcalase酶解蛋清粉制备抗凝血肽的工艺优化

采用Alcalase碱性蛋白酶酶解蛋清粉制备食源性抗凝血肽。结果表明:底物浓度过大会抑制水解度的增长,底物质量分数为1%时蛋白质完全水解后的产物抗凝血活性最佳;高温和低温均对水解度有影响,低温酶解产物的抗凝血活性较好;pH值对水解度的影响与Alcalase的最适pH值有关;pH值为7时,抗凝血活性最好;酶/底物浓度增大,但底物不变的情况下,对水解度的提高不明显,酶/底物浓度过大,导致抗凝血活性降低。考虑交互作用经试验优化设计确定的酶解最佳工艺参数为:底物质量分数为1%,酶解温度为50 ℃,酶/底物质量分数为5%,酶解pH为8。在该条件下水解2 h,凝血抑制率达到68.92%。     

章鱼内脏胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

通过热处理、硫酸铵盐析、膜超滤及SP-Sepharose 离子交换层析,从章鱼内脏中纯化得到一种胰蛋白酶抑制剂 (Octopus Trypsin Inhibitor ,OTI)．Tricine-SDS-PAGE 电泳结果显示,OTI的分子质量约为6500 u．性质分析结果表明:OTI在pH=1.0~11.0缓冲液中孵育30 min,抑制活性稳定;在100 ℃下加热1 h、2 h 后仍分别具有90% 和65% 的抑制活性,具有良好的pH值稳定性和热稳定性;OTI能够显著抑制胰蛋白酶的活性,对胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶几乎无抑制活性;OTI能够有效抑制蓝圆鲹肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶 (MBSP) 引起的肌球蛋白降解．     

猪皮明胶抗冻多肽的制备及其低温保护活性研究

以食品源猪皮明胶为原料,用碱性蛋白酶水解,制备抗冻多肽,并对影响碱性蛋白酶水解的各个因素进行研究. 以水解制备的多肽对过氧化氢酶的低温保护活性为指标,在单因素实验的基础上,通过正交实验确定碱性蛋白酶水解猪皮明胶的最适pH为9.0,最适温度是37℃,酶和底物比例为1∶50,酶解时间3h. 在此条件下制备的抗冻多肽对过氧化氢酶的低温保护活性为88.2%. 与牛血清蛋白和商业抗冻剂（4%蔗糖+4%山梨醇）比较,抗冻多肽表现出更优越的抗冻活性,且其抗冻活性和浓度成正相关关系.     

天然抗冻多肽的制备、 分离及细菌低温保护活性研究

利用热水抽提法提取鲨鱼皮明胶,控制酶法水解条件制备天然抗冻多肽.以细菌低温保护活性为指标,筛选蛋白水解酶种类及酶解时间,利用Sephadex G-50凝胶过滤色谱、SP-Sephadex C-25强阳离子交换色谱等分离手段进行分离,得到细菌低温保护高活性组分.结果表明,酶解鲨鱼皮明胶得到高活性抗冻多肽的最适蛋白水解酶为酸性蛋白酶,酶解温度50℃、pH 3.0、酶/底物3 000 U·g-1、底物浓度3%、酶解时间1 h;经过Sephadex G-50凝胶过滤色谱、SP-Sephadex C-25强阳离子交换色谱等分离手段得到阳离子的P2组分,经过细菌低温保护测试,当浓度为500μg·mL-1时,大肠杆菌的存活率达到80.8%.分离得到的抗冻多肽具有较高的抗冻活性,可望应用于食品、医药等产业中.     

日本鳗鲡胰蛋白酶的分离纯化及性质分析

通过硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析、Phenyl-Sepharose疏水柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤柱层析等方法,从日本鳗鲡（Anguilla japonica）肝胰腺中分离纯化得到胰蛋白酶,SDS-PAGE显示其分子质量为21.5 ku。以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物,胰蛋白酶最适温度和最适pH值分别为40 ℃和8.5。动力学实验表明,Km值和kcat值分别为3.1 μmol/L和59.9 s-1。丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc SC、PMSF、benzamidine、STI等对其有特异抑制效果。底物特异性结果显示,该酶特异分解Arg和Lys残基的C端。肽质量指纹图谱获得5个片段,共76个氨基酸残基,与基因文库中的日本鳗鲡胰蛋白酶氨基酸序列完全相同。说明本研究所纯化的蛋白质为胰蛋白酶。