类固醇激素受体在扬子鳄睾丸表达的免疫细胞化学研究

用免疫细胞化学方法对雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR) 在扬子鳄睾丸中进行定位研究.结果表明,三种类固醇激素受体在扬子鳄睾丸中都有分布:雄激素受体在睾丸的肌样细胞和支持细胞中呈阳性反应,雌激素受体在睾丸的间质细胞中呈 阳性反应,孕激素受体在睾丸的生精细胞中呈阳性反应.推测结果表明,雄激素受体在扬子 鳄精子发生过程有重要作用;雌激素受体可能在扬子鳄睾丸发育过程中影响睾丸间质细胞雄性激素的分泌,进而调节生精过程和精子发育成熟,孕激素受体可能通过转换成AR和ER来对精子发生进行调节.这些结果为证明性类固醇激素参与调节扬子鳄性腺生殖内分泌调控提供了重要的形态学新证据.     

小鼠精原干细胞的分离、分选、移植和培养

精原干细胞具有自我增殖和分化为精子的能力。精原干细胞的培养、移植和体外诱导分化等研究将使我们最终阐明精原干细胞的自我更新机制和精子发生机理。经过一年多的研究,我们不仅建立了用含血清培养基对分离的乳鼠睾丸细胞进行差异贴壁分选来富集生殖细胞的简单方法,而且成功地对分选出的精原干细胞进行了近一个月的无血清培养。流式分析结果表明,差异贴壁分选能将精原干细胞富集11倍以上。移植分析表明,分选出的精原干细胞具有在受体鼠的曲精小管中产生克隆的能力和正常生精作用。免疫细胞化学和RT-PCR检测表明,培养的细胞表达精原干细胞标志基因。该研究为体外长期培养小鼠或其它哺乳动物的精原干细胞提供了一个范例,也为利用基因修饰的精原干细胞通过移植产生转基因动物奠定了基础。     

动物精子发生及成熟过程中凝集素受体的分布与变化

对各种动物精子发生与成熟过程中生精细胞表面凝集素受体的变化做了综述 .精子发生过程伴随着不同凝集素受体的出现和变化 ,这些受体是由生精细胞自身合成的 ;精子在成熟过程中 ,质膜凝集素受体的合成、修饰及分布会进一步发生变化 ,这些变化与精子获得与卵子进行识别、粘附、结合等受精能力密切相关 .     

花生凝集素受体在中华绒螯蟹生精细胞的分布

以中华绒螯蟹为材料,应用凝集素印迹法检测中华绒螯蟹生精细胞中的花生凝集素受体.以凝集素组织化学技术为手段,采用生物素标记的花生凝集素对中华绒螯蟹精子发生过程中花生凝集素受体进行了标记,研究精子发生过程中花生凝集素受体的分布特征.结果表明,中华绒螯蟹生精细胞中的花生凝集素受体的分子质量为72 ku;精子发生过程中,不同的生精细胞膜有不同程度的阳性标记.精原细胞质膜上有较强的阳性标记,呈深棕色;精母细胞的质膜阳性标记减少;精细胞与精母细胞染色程度相似.PNA受体在生精细胞中分布,可能与生殖细胞发育以及生殖细胞之间或者生殖细胞与体细胞之间的信息传递有关.精子质膜、顶体区域也有阳性标记,这可能与精卵识别及结合等受精过程息息相关.     

绒山羊曲细精管生殖细胞的长期培养和精子发生过程的观察

哺乳动物精子发生过程是生殖生物学的重要研究课题之一.为了开展对山羊精子发生过程的研究,我们首次建立了绒山羊睾丸生殖细胞原代培养方法.原代生殖细胞和支持细胞(Sertolicells)由绒山羊睾丸曲细精管组织块产生,在体外共培养超过三个月.在共培养期间,观察到绒山羊的精原干细胞分化为精母细胞和精子细胞的形态变化过程.这一方法的建立为山羊精子发生过程的研究和应用打下了基础.实验结果显示,在没有添加任何生长因子的条件下,绒山羊睾丸生殖细胞长期增生分化,不断产生精子细胞.这一结果暗示了组织块和共生的支持细胞为生殖细胞的增生和分化提供了营养因子和调节因子.生成的游离精子细胞最后全部死亡,暗示这一共培养体系不能提供变态过程所需因子.     

基于ChIP-seq筛选睾丸支持细胞中雄激素受体靶基因初步研究

雄激素及其受体在精子发生中有重要作用.寻找并鉴定更多雄激素及其受体的靶基因,对阐明雄激素及其受体介导精子发生的分子机制,解析其调控精子发生的网络具有非常重要的科学意义.在本研究中,我们分离了睾丸支持细胞,以睾酮刺激,并以ARKO小鼠睾丸作为背景对照,进行ChIP-seq和分析验证.数据分析显示了8679个差异表达基因,其中4830个基因在睾酮处理组表达上调,3849个表达下调.我们从差异基因中筛取了43个靶基因进行验证,其中39个基因的启动子区域找到了ARE结合位点.候选靶基因介导雄激素调控精子发生的分子机制仍有待进一步研究.本项目初步鉴定的靶基因可为进一步深入系统研究雄激素及其受体调控精子发生的机制提供参考.     

泸州医学院附属医院成功开展心脏移植动物实验

<正>泸医附院继成功开展肝、肾移植动物实验后,8月23日再次成功进行了第三次器官(心脏)移植动物实验。此次动物实验由泸州医学院党委书记廖斌教授带领的泸医附院心脏外科器官移植专家团队,在手术室、麻醉科等科室医护人员的密切配合下,经过5个多小时供体猪心脏的摘取、修剪等环节,成功将供体猪的心脏移植到受体猪体内,并使移植心脏恢复了良好的搏动,心脏移植动物实验取得圆满成功。     

我国男性避孕研究的发展前景

男性避孕研究长期未得到足够重视.文中综述了国内外相关研究的最新进展.重点评述了我国在用棉酚、长效睾酮和温浴睾丸作为抗精子发生所取得的成就和存在的问题,提出了"睾丸局部温浴组合低剂量棉酚","长效睾酮组合低剂量棉酚"和"睾丸局部温浴组合缓释长效睾酮"3种不同组合的临床研究方案和理论依据.对睾丸局部热压主要促进I-Ⅳ期和Ⅸ-Ⅷ精细胞凋亡,长效睾酮主要促使Ⅶ-Ⅷ期的精细胞凋亡,而低剂量棉酚除对睾丸变态精子有作用外,主要影响附睾精子.这些组合各作用在精子发生的不同阶段,通过不同的信息通路作用于精子发生和形成的不同位点,优势互补,可大大降低单独应用时的剂量、作用时间和强度,避免各自使用时的副作用,产生最大的组合效应,符合安全、有效和可逆的理想结果.     

小鼠精原干细胞的体外培养与鉴定

建立一种简单、有效体外分离和培养精原干细胞（Spermatogonia stem cell,SSCs）的方法。采用酶消化6—8d新生小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液后进行培养,碱性磷酸酶（AKP）染色和间接免疫荧光对培养的细胞进行鉴定;结果显示：SSCs培养3～5天可观察到细胞克隆的产生,AKP染色强阳性;间接免疫荧光显示GCNF阴性,oct-4、c—kit均呈阳性反应。由此可知以DMEM＋15％胎牛血清＋白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）＋L-谷氨酰胺等为培养基,成功建立了精原干细胞的体外培养体系。     

睾丸支持细胞功能的研究进展*

摘要: 支持细胞位于睾丸曲细精管内皮,作为与生精细胞接触的惟一体细胞,在生精过程中起着至关重要的调控作 用。支持细胞在精子发生过程中可为精子细胞提供结构支持; 他分泌的各种蛋白质参与精子发生所需物质的转 运; 同时支持细胞表达一些膜蛋白,促进局部免疫豁免形成,为精子发生提供有利的微环境; 再者,支持细胞通过发 挥粘附与吞噬作用,清除精子发生中凋亡的精子细胞。随着研究的深入,近年来对支持细胞又有了新的认识。     

GDNF对睾丸功能的调节

在睾丸中,Sertoli’s细胞等细胞表达胶质细胞源神经营养因子（Glial cell line—derived neuotrophic factor,GDNF）,通过旁分泌或自分泌方式作用于生精细胞和Sertoli’s细胞等,调节精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）的自我更新和分化,并促进Sertoli’s细胞的增殖以及血睾屏障的形成等。     

大天鹅睾丸和附睾的组织结构及EGF,Bax,Bcl-2蛋白和iNOS的表达

为了解大天鹅(Cygnus cygnus)睾丸和附睾的组织结构特征及相关活性物质的表达情况,用生物显微技术观察了大天鹅睾丸和附睾的组织结构,用免疫组织化学方法检测了EGF,Bax蛋白,Bcl-2蛋白和iNOS在睾丸和附睾中的表达.结果表明,大天鹅睾丸内生精小管主要由支持细胞和各级生精细胞构成,众多生精小管被睾丸间质隔开;附睾由输出小管和附睾管组成;大天鹅睾丸生精小管直径、生殖细胞大小、附睾管直径及上皮厚度等与其他脊椎动物存在差异;EGF,Bax蛋白,Bcl-2蛋白在睾丸生精小管管周的肌样细胞、精原细胞、精母细胞、精子细胞、间质细胞和附睾管上皮细胞等处呈免疫反应阳性;iNOS在睾丸间质内的血管壁及间质细胞、附睾管上皮细胞、附睾结缔组织等处有阳性表达;EGF可能参与其精子发生、获能及激素生成的调控过程;Bax蛋白和Bcl-2蛋白可能共同参与调控正常大天鹅睾丸和附睾细胞的凋亡;iNOS可能也参与雄性大天鹅各种生殖活动的调节.     

导入蓖麻毒蛋白的供体淋巴细胞在小鼠皮肤移植中产生的特异免疫耐受

以小鼠为研究对象进行皮肤移植,受体为BALB/C鼠,供体为C₅₇BL/6鼠。用氯化钙介导蓖麻毒蛋白(ricin)进入供体鼠的脾细胞制成毒细胞,适时地注入受体体内。带有蓖麻毒蛋白供体脾细胞,一方面可提供特异移植抗原(主要组织相容性抗原)使特异的T,B淋巴细胞识;另一方面,它被识别裂解后,释放蓖麻毒蛋白,又可杀伤与其识别的T,B淋巴细胞,使受体对供体移植物产生耐受。实验共设两组,在皮肤移植前后分别用包埋蓖麻毒蛋白的供体脾细胞处理,两组移植皮片存活时间均比相应对照组有显著延长(t＞t_0.01)。混合淋巴细胞培养实验和淋巴细胞转化实验证明了实验组对供体细胞的免疫应答及免疫细胞的分化能力均受到抑制。对这一新设想进行了初步的研究。     

Jagged1在树突状细胞介导淋巴细胞诱导皮肤移植免疫耐受中的作用

目的: 探讨Jagged1在树突状细胞(DC)介导淋巴细胞诱导同种异基因皮肤移植免疫耐受中的作用.方法: C57BL/6小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体行皮肤移植术,受体小鼠分为对照组,Jagged1 DAPT处理组和Jagged1处理组.取供体小鼠淋巴细胞加入经rmIL-4和rmGM-CSF处理9 d的供体骨髓细胞中,当日和隔日分别加入Jagged1和DAPT.2 d后取淋巴细胞,于皮肤移植第0天、第2天和第4天,经尾静脉注入受体小鼠.观察皮肤移植物存活时间和移植物病理变化,并检测受体小鼠混合淋巴细胞反应和迟发型超敏反应.结果: Jagged1处理组的皮肤移植物平均存活83.6 d,显著长于其它各组(P<0.01); Jagged1处理组移植皮片内浸润的炎细胞数量明显减少;在混合淋巴细胞反应中,Jagged1处理组小鼠对供体小鼠呈现低反应性(P<0.01),而对第三方无关供体KM小鼠表现强烈的增殖反应,Jagged1处理组小鼠在迟发型超敏反应中也表现出显著的低反应性(P<0.01).结论: 输注Jagged1联合DC处理的淋巴细胞诱导受体获得供体抗原特异性的免疫耐受.     

昆明白小鼠精原干细胞的体外培养

建立了一种小鼠精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的分离、纯化和培养体系,主要包括SSCs的差异贴壁分选(differential adherence selection)、无血清培养基和MEF(mouse embryonic fibro-blast)饲养层。无血清培养基以StemPro-34 SFM为基础培养液,补充多种添加剂和GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor)、可溶性GFRα1(soluble GDNF family receptorα-1)和bFGF(basic fibroblastgrowth factor)等因子。昆明白小鼠(KMmice)幼鼠的生精细胞在这一培养体系中能够培养和增殖1个月。RT-PCR检测还表明培养的细胞同时表达Oct4和Sox2,说明SSCs与ESCs两者的自我复制可能享有共同的维持机制。     

抗草甘膦转基因大豆对雄鼠睾丸的影响

以雄性昆明小鼠为动物模型,分别以抗草甘膦转基因大豆和非转基因大豆饲料喂食,于30、90 d后,取其睾丸.采用流式细胞术检测睾丸组织中各生殖周期细胞比例、Hoechst33258染色观察睾丸细胞凋亡、组织化学染色技术观察睾丸组织病理学变化.研究抗草甘膦转基因大豆对雄鼠睾丸的影响.结果显示,30、90 d实验组和对照组小鼠睾丸精细胞单倍体、2倍体、4倍体比例均正常且趋于稳定,单倍体比例占主导地位,且实验组与对照组相比无统计学差异.在荧光显微镜下实验组睾丸细胞的细胞核呈正常的蓝色,与对照组相比,未发现明显的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,颜色有些发白的凋亡细胞.组织病理观察也未发现两组小鼠的睾丸出现明显病理损伤.30 d喂食抗草甘膦转基因大豆急性毒理研究和90 d喂食抗草甘膦转基因大豆亚慢性毒理研究对雄鼠睾丸均无显著影响.     

CREBBP在小鼠睾丸发育过程中表达模式的研究

睾丸是雄性动物最为重要的生殖器官,主要由曲细精管和间质构成。雄性哺乳动物持续的精子发生依赖于精原干细胞。精原干细胞通过有丝分裂自我更新,并在一些因子的诱导下启动分化进一步发育为精母细胞。研究睾丸中各细胞基因的表达调控对男性不育和睾丸生殖细胞肿瘤的治疗具有十分重要的意义。本研究利用RT-PCR、免疫组织化学及免疫荧光双染的方法主要研究了CREBBP在小鼠睾丸中的表达模式,结果显示CREBBP主要在精原细胞中表达,并在增殖状态的精原细胞中有表达,但在分化后启动了减数分裂的细胞中未检测到阳性信号。因此我们推测CREBBP可能参与了精原细胞的增殖,为后期精原细胞自我更新机制的研究提供理论基础。     

实验用小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞为核供体生产转基因克隆胚胎

目的比较不同类型体细胞对生产转基因克隆胚胎效率的影响。方法利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-N1转染到五指山小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞,经过G418筛选后均获得了阳性细胞株。然后分别以两种类型转基因细胞以及未转基因细胞为核供体进行体细胞核移植,比较不同类型供体细胞克隆胚胎的囊胚发育率。结果胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞克隆胚的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,8.3%vs.7.1%);转基因胎儿成纤维细胞(9.6%)和转基因骨髓间充质细胞(9.9%)克隆胚胎的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,9.6%vs.9.9%);每一种类型供体细胞转基因与否对克隆胚的囊胚发育率无影响(P>0.05)。结论通过体细胞核移植技术,小型猪骨髓间充质细胞与胎儿成纤维细胞均可有效地生产转基因囊胚。     

转基因小麦环境释放中基因漂移研究

基因漂移供体是转基因小麦，受体有转基因小麦的非转基因分离体、受体对照品系和地方小麦品种，以外源uidA基因表达作为基因漂移的分子标记，在供体开花期间，距供体5个不同距离上收集花粉，约80％的花粉分布在距供体中心15m以内，距离35m处只检测到约6％的花粉，在11个检测样点检测受体和供体间杂交率，供体与分离体混种同一小区时，基因漂移频率较高(1．08％)；与其受体对照播种于相邻小区(相距约0．5m)时，基因漂移频率居中(0．63％)；地方品种距供体边缘0．5～2．5m处，频率较低(0．25％)；3m以外没有检测到基因漂移，认为转基因小麦基因漂移距离应在3m以内。     

供体与受体双光子激发吸收截面比值的测量

针对供体和受体浓度比恒定为1:1的供体受体对,提出了一种利用荧光共振能量转移(FRET)原理测量受体和供体双光子激发吸收截面比值的新方法.由于采用双通道荧光比率测量技术,该方法消除了荧光基团浓度、激发光强度波动、激发区域的不均匀性以及随机杂散信号等因素对测量的影响.利用该方法在活体HeLa细胞中测量了钙离子探针Cameleon(YC2.1)中的受体YFP和供体CFP在710～930 nm波长范围内的双光子激发吸收截面之比.