微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的表达及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.) ALW1的基因组为模板,使用褐藻胶裂解酶AlgL14特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p MD18-T载体后进行测序,并对该基因编码的蛋白质序列进行生物信息学分析。将目的基因插入pET-28α(+)表达载体,转入Escherichia. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并利用亲和层析进行重组蛋白纯化。结果显示,克隆基因的大小为1 350 bp,预测编码含有449个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的褐藻胶裂解酶序列具有一定的相似性,预测克隆的目的基因编码褐藻胶裂解酶,归属于PL-14家族。褐藻胶裂解酶AlgL14的理论分子质量大小为48. 772 ku,理论等电点为6. 27。采用同源建模法建立菌株ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的三维结构,富含β-折叠。将目的基因在E. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并纯化获得重组褐藻胶裂解酶。SDS-PAGE分析显示,表达的目的蛋白分子质量约为48. 8 ku。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究

以产褐藻胶裂解酶的紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)为出发菌株,应用基因工程技术,将褐藻胶裂解酶aly基因进行克隆,并构建了该基因的重组表达载体pET23b(+)-aly.通过表达条件的初步优化,实现了aly基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达.在IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为8h,诱导温度为16℃的条件下,细胞破壁后上清中ALY粗酶液活力为6U/mg.根据褐藻胶裂解酶ALY的蛋白质结构预测结果推断该酶属于Algi-nate lyase-2家族,理论pI为8.85,理论分子量大小为28 500,化学式为C1252N1920H356O394S9.SDS-PAGE蛋白电泳检测发现,ALY蛋白的分子量约为28 000,与预测的蛋白分子量较为接近.     

重组褐藻胶裂解酶酶解工艺的优化及产物分析

为探索假交替单胞菌（Pseudomonas syringae）重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的动态过程变化,采用DNS法和苯酚－硫酸法分别测定体系还原糖和总糖,根据二者比例,得出酶解产物随时间变化的平均聚合度,从而研究各因素对褐藻胶降解过程的影响,确定褐藻胶酶解工艺条件。结果表明,重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的适宜工艺条件为:水解温度25 ℃,pH 7.5,初始底物质量浓度7 g/L,加酶量0.48 U,静置条件下酶解反应210 min。在此工艺条件下,产生的还原糖的质量浓度达0.878 g/L,平均聚合度为3。酶解终产物的质谱鉴定结果显示为单糖、二糖和四糖。     

产微球茎菌琼胶酶基因的克隆及生物信息学分析

以琼脂为唯一碳源的培养基分离出一株产琼胶酶的海洋菌株AG1,16S rRNA基因序列分析显示,该菌株为产微球茎菌（Microbulbifer sp.）。以菌株AG1的基因组为模板,使用琼胶酶特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pMD18-T载体后进行测序。结果显示,克隆基因的大小为1302 bp,预测编码含有433个氨基酸残基的蛋白质。对该蛋白质进行生物信息学分析,结果表明,该蛋白质序列与来自耐热微泡菌（Microbulbifer thermotolerans）的琼胶酶氨基酸序列相似性为100%,预测本研究克隆的基因编码琼胶酶。该琼胶酶的理论分子质量大小为48.2 ku,理论等电点为5.42。采用同源建模法建立Microbulbifer sp.AG1琼胶酶的三维结构,富含β-折叠。     

梅花鹿过氧化氢酶基因的克隆与表达

克隆得到梅花鹿过氧化氢酶基因序列,已提交Genbank登录(HQ877674).基因编码区全长1 584 bp,编码527个氨基酸,理论计算分子量为60 027.4 Da,理论计算等电点为6.67,预测蛋白质结构中不含有二硫键,在蛋白质序列中,具有过氧化氢酶家族活性中心保守序列和过氧化氢酶家族亚铁血红素保守序列,其DNA序列和蛋白质序列均与Bos taurus来源过氧化氢酶的同源关系最为接近.使用pPICZαC质粒和毕赤酵母GS115菌株,成功异源表达该基因,对诱导表达的发酵上清液进行活性测定,酶活为463 U·mL-1.     

海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究

以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.zb7-4)发酵制备褐藻胶裂解酶粗酶液,采用弱阴离子DEAE交换层析分离褐藻胶裂解酶,分析纯化褐藻胶裂解酶Alg L的酶学特性.结果表明:Alg L的表观分子质量约为32 ku,比活力为(208.26±5.87)U·mg-1;其最适反应pH为7.0,在pH为6.0~10.0范围内稳定性较好,保温1 h仍能保持80%以上的相对酶活力;最适反应温度50℃,在40℃保温30 min,其残余酶活力高于80%;Cu2+、Cr3+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显;该酶具有较好的盐耐受性,在3 mol·L-1Na Cl反应体系中保温2 h,仍残余66%酶活力.动力学参数Km、Vmax、Kcat测定表明,该酶对聚古罗糖醛酸钠(PG)亲和力较高,为偏好聚甘露糖醛酸钠(PM)裂解作用的双功能酶.     

微泡菌ALW1几丁质酶Chi18A的克隆及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.)ALW1的基因组为模板,利用几丁质酶基因的特异性引物进行PCR扩增,然后将产物插入到pMD18-T载体后进行DNA序列测定,并对目的基因编码的蛋白质序列进行信息学分析。结果显示,克隆的目的基因大小为1644 bp,预测编码含有547个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的几丁质酶序列具有70%左右的相似性,表明预测目的基因编码几丁质酶。该蛋白质具有2个几丁质结合结构域和1个GH18家族酶的催化结构域,属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)家族18,命名为几丁质酶Chi18A。模拟的三维结构显示,Chi18A含有(βα)_8桶状结构。     

褐藻胶裂解酶发酵工艺优化及其中试放大

对产微球茎菌（Microbulbifer sp.）ALW1发酵产褐藻胶裂解酶5 L罐发酵工艺进行优化,建立褐藻胶裂解酶的高产发酵工艺。结果表明:海藻酸钠质量浓度为1 g/L时效果最好,浓度减半或加倍都会使酶活力下降;25 ℃比20 ℃更利于产酶;pH值控制在7.5时比自然条件下发酵产酶高峰提前,产酶量变化不大;在此基础上,对罐上工艺进行中试放大,20 L发酵罐酶活力最高为57.0 U/mL,200 L罐酶活力最高为43.5 U/mL,500 L罐酶活力最高为38.3 U/mL,分别是小试水平的39.6%、30.2%、26.5%。     

高效褐藻胶降解菌的筛选与产酶条件优化

以海藻酸钠为唯一碳源,从天然腐烂海带中筛选得到一株高效褐藻胶降解菌株53#,经形态学观察和16S r RNA鉴定,确定为类芽孢杆菌Paenibacillus agaridevorans。采用正交试验方法,以p H、温度、Na Cl浓度和海藻酸钠初始浓度为影响因素,对该菌株的产酶条件进行优化,得到53#菌的最佳产酶条件:p H=8,25℃,Na Cl浓度15 g/L,海藻酸钠初始浓度15 g/L。在最佳产酶条件下,褐藻胶裂解酶最大酶活可达390.53±17.32U/m L。筛选得到的类芽孢杆菌Paenibacillus agaridevorans 53#具有易于培养、产酶速度快和酶活力高等优点,能够实现褐藻胶的高效糖化,在褐藻生产生物乙醇领域具有潜在利用价值。     

产褐藻胶裂解酶菌株的筛选及发酵条件优化

为进一步探索高产褐藻胶裂解酶菌株,促进其工业化应用,以褐藻酸钠为唯一碳源筛选培养基,从鲍鱼内脏中筛选出一株高产褐藻胶裂解酶菌株B4,通过形态学观察和系统发育分析,鉴定为弧菌属细菌Vibrio sp.B4。通过单因素实验对B4菌株的发酵条件和发酵培养基进行优化,获得发酵培养基的最适碳源为褐藻酸钠10g/L,最适氮源为(NH4)2SO410g/L,最适发酵条件为温度30℃,接种量1%,培养基初始pH 6.0。在单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman(PB)筛选出3个影响产酶活力的显著因素:(NH4)2SO4浓度、pH、接种量。通过响应面进一步分析优化,得到最佳的发酵培养基为褐藻酸钠10g/L,(NH_4)_2SO_4 10.91g/L,NaCl 10g/L,KH_2PO_4 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,CaCl_2 0.2g/L,FeSO_4·7H_2O 0.02g/L,最佳发酵条件为温度30℃,接种量1.1%,起始pH 6.07。在最佳培养条件下,褐藻胶裂解酶活力可达19.09U/mL,比基础培养条件下提高了3.67倍。该菌经过产酶发酵条件的优化,酶活力得到较大幅度的提高,且其发酵产酶时间短,可为褐藻胶裂解酶的进一步研究应用提供参考。