微生物植酶动力学性质的研究

本实验所用的植酸酶是把无花果曲霉的植酸酶基因导入大肠杆菌后所袁达产生的。考察植酸酶的动力学特性，结果表明，该植酸酶80℃时基本没有活性，最适反应温度为50℃；最适作用的pH值为7．8；Vm=2．73μmol/（Lmin），Km=34．2μmol／L。     

利用酶法生产肌醇初步研究

植酸酶能将植酸及其二价盐类菲丁水解生成磷脂酰肌醇,在磷酸酯酶的继续作用下,磷脂酰肌醇被分解为肌醇。无花果曲霉能同时分泌植酸酶和磷酸酯酶。通过对无花果曲霉（Ａ．ｆｉｃｕｕｍＡ．ｓ３．３２４）产生植酸酶和磷酸酯酶条件的研究,在确定的最佳条件下,植酸酶和磷酸酯酶活力分别达到５．７ｕ／ｍＬ、０．５３３ｕ／ｍＬ。用所得发酵液水解菲丁制备肌醇,使肌醇的转化率达１０．３％。     

产脂肪酸菌种的筛选及部分酶学性质

从含油污泥中筛选出一株产脂肪酶活力较高的微球菌,此菌最适产酶条件：2％的蛋白胨为氮源,1％的橄榄油为碳源,pH8.0,28℃培养48h．酶学性质研究发现,在28℃和45℃脂肪酶有较高催化活力,其中28℃活力更高些,最佳反应pH为8．0,pH稳定范围在6．0～10．0之间,Ca2 和K 对酶有激活作用,Fe2 ,Cu2 和Mn2 等对酶有抑制作用．     

草鱼碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质研究

用Tris—HCl缓冲液抽提，硫酸铵分级沉淀，DEAE-纤维素和葡聚糖凝胶层析，从草鱼肠中提取出碱性磷酸酶（ALP）．提取倍数为6．74，比活为684U／mg蛋白．酶液经PAGE呈现单一带，该酶催化对硝基苯磷酸二钠（pNPP）水解反应的最适pH值为10．41，最适温度为27℃，Km值为1．01mmol／L，酶的热稳定性与pH稳定性研究表明：该酶在pH6．6～11．5区间和在温度低于45℃下稳定．研究金属离子对酶活力影响的结果表明：一价金属离子Li^＋、Na^＋和K^＋对酶活力没有影响；二价金属离子Mg^2＋、Mn^2＋和Co^2＋对酶有不同程度的激活作用；Zn^2＋对酶有抑制作用．     

米曲霉(Aspergillus oryzae)植酸酶的分离纯化及性质研究

从5株霉菌中筛选出1株产胞外植酸酶最高的菌株(Aspcrgillusoryxae;简称霉菌3号)。经发酵,硫酸铵分级沉淀,Sephadex G—100凝胶过滤、SE—Sephadex G—50层析和电泳分离,获得2种植酸同工酶.此两种酶的分子量为40000d,等电点分别为4.5和4.8,最适pH为2.7和5.6,最适温度为50℃,K_m值为50μmol/L。SDS、Fe_~(2+)对酶活力无影响;Mn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)有激活作用;Cu~(2+)有抑制作用。     

鲍鱼碱性磷酸酶的分离纯化和性质研究

以杂色鲍(Haliotis diversicolor)内脏为原料,经Tris HCl缓冲液(pH 7.5,含0.1mol/L NaCl)抽提,正丁醇处理,硫酸铵分级沉淀分离,DE 32离子交换、Sephadex G 150分子筛、DE 32纯化,得到电泳单一纯的碱性磷酸酶制剂,比活力为1 226 U/mg.酶学性质和动力学性质研究表明:该酶催化对硝基苯磷酸水解反应的最适 pH值为 10.08,最适温度为48℃.米氏常数Km 值为0.80 mmol/L,Vm 值为20.1 mmol/L·min-1(pH 10.0,37℃).酶的热稳定性研究表明:该酶在pH 7~11区间和在温度低于55℃下稳定.金属离子对酶活力的影响结果表明:Li+、Na+和K+对酶活力没有影响,Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+和Co2+对酶有不同程度的激活作用,而Cu2+、Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ag+、Bi2+和Pb2+等对酶起抑制作用.     

植酸酶基因在毕赤酶母中表达及表达酶性质研究

PCR扩增无花果曲霉As3.324的植酸酶基因phyA I，测序分析表明，phyA I全长1515bp,其中111个核苷酸为内含子序列，共编码467个氨基酸，N墙的19个氨基酸为信号肽，序列中存在10个潜在的N-糖基化位点，构建phyA I的酶母转化载体pPIC9K/phyA Ⅱ，电击法转化毕赤酶母GS115，获得植物酶基因重组酶母菌GS115/phyA Ⅱ，其发酵酶活性比As3.324提高了33倍，GS115/phyA Ⅱ植酸酶作用pH有两个峰值，分别为2.5和4.5，最适作用温度为60℃，与As3.324相比，重组毕赤酶母GS115/phyA Ⅱ植酸酶的热稳定性有显著提高。     

重组毕赤酵母产匍枝根霉内切葡聚糖酶Ⅱ的分离纯化及其酶学性质研究

将来源于匍枝根霉的endoglucanase Ⅱ(egⅡ)在毕赤酵母中实现异源表达,对构建完成的重组毕赤酵母进行高密度发酵,制备目标酶蛋白．发酵液经 Ni 柱分离纯化,得到分子量大小约为38 kDa,比酶活为37．8 IU/mg的蛋白．酶学性质研究表明：该酶最适反应温度为55℃,最适反应 pH 为4．8;Mn2＋、Zn2＋、Fe2＋对egⅡ的酶活力有一定的激活作用,Cu2＋对egⅡ酶活有抑制作用,Mg2＋、Co2＋、Na＋和K＋等离子对该酶的催化活力没有明显影响;该酶以CMC-Na为底物时其反应米氏常数为2．04 mg/ml．     

固定化α_葡萄糖苷酶的性质研究

研究了以微球形壳聚糖为载体采用吸附－交联法制备的固定化α-葡萄糖苷酶（简称“ITGL”）的理化特性。结果表明,ITGL的最适pH值为4．5,游离酶（简称“TGL”）的最适pH值为5．0;ITGL的最适温度达到70℃,比TGL的提高5℃,并且ITGL的最适作用温度范围显著变宽,在40－70℃范围内活力较为稳定;ITGL的酸碱稳定性、热稳定性和贮存稳定性均比TGL有较大提高;TGL和ITGL均对高离子强度和脲不稳定;低浓度的Ca^2 和Mg^2 对TGL和ITGL的活力均有增强作用,而Fe^2 、Ag^2 、Cu^2 、Hg^2 对TGL和ITGL的活力均有明显的抑制作用;ITGL的操作半衰期可达24d;以麦芽糖为底物时,ITGL的反应动力学参数无显著变化。     

高纯度烟草过氧化物酶的酶学特性研究

从K326的烟叶中采用除植物褐色素新技术，经分离纯化，得到单一过氧化物酶I（TOP I），该酶是一种以血红素为辅基的含铁蛋白质。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOF－MS）测得TOP I分子量为21888．5Da，等电点pI为3．5；酶反应的最适pH为6．0，最适温度为45℃，70℃保温15min残余活力为50％，具有良好的热稳定性，动力学分析表明：烟草中的过氧化物酶I与愈创木酚（一元酚）结合力最强，邻苯二酚（二元酚）次之，焦性没食子酸（三元酚）作用较小。TOP I和Km(愈创木酚）为0．132mmol/L;Km(H2O2)为0．598mmol/L.N3^-,CN^-1,Fe^3 ,Fe^2 和Sn^2对酶有较强烈的抑制作用，重金属离子Ag^ ,Pb^2 ,Cu^2 对该酶的活性有激活作用，而NO2^-、Hg^2 ,Cr^3 对酶活力无显著影响。     

植酸酶基因在毕赤酵母中表达及表达酶性质研究

PCR扩增无花果曲霉 As3 .3 2 4的植酸酶基因 phy A ,测序分析表明 ,phy A 全长1 5 1 5 bp,其中 1 1 1个核苷酸为内含子序列 ,共编码 467个氨基酸 ,N端的 1 9个氨基酸为信号肽 ,序列中存在 1 0个潜在的 N-糖基化位点 .构建 phy A 的酵母转化载体 p PIC9K/phy A ,电击法转化毕赤酵母 GS1 1 5 ,获得植酸酶基因重组酵母菌 GS1 1 5 /phy A .其发酵酶活性比 As3 .3 2 4提高了 3 3倍 .GS1 1 5 /phy A 植酸酶作用 p H有两个峰值 ,分别为 2 .5和4.5 ,最适作用温度为 60℃ .与 As3 .3 2 4相比 ,重组毕赤酵母 GS1 1 5 /phy A 植酸酶的热稳定性有显著提高 .     

植酸酶及其应用

在以植物性原料为主的畜禽配合饲料中,大部分磷以植酸磷的形式存在,畜禽因缺乏内源性的植酸酶而对其的利用率极低。本文对配合饲料中添加植酸酶进行了研究。     

毛细管电泳鉴定植酸酶的纯度研究

考察了用毛细管电泳对植酸酶纯度的鉴定条件缓冲溶液的种类、浓度、pH值.在pH为9,浓度为60mM的硼砂溶液中能对植酸酶纯度进行快速、高效的鉴定.     

植酸酶生物肥料对农作物生长的促进作用

采用实验室培养和田间实验相结合的方法,研究植酸酶生物肥料对玉米、黄瓜和茼蒿生长的促进作用。结果表明,对3种作物施加不同剂量的植酸酶生物肥料后,同对照组相比,玉米苗的干重和株高、黄瓜秧苗的株高以及茼蒿幼苗的叶绿素含量均有不同程度的提高,作物秧苗的生长状况与肥料剂量呈正相关.灭菌处理后的植酸酶生物肥料对农作物生长也有促进作用,但效果低于同等剂量的未灭菌肥料.     

Expression, purification and characterization of a phyAm-phyCs fusion phytase

The phyA^m gene encoding acid phytase and optimized neutral phytase phyCs gene were inserted into expression vector pPIC9K in correct orientation and transformed into Pichiapastoris in order to expand the pH profile ofphytase and decrease the cost of production. The fusion phytase phyA^m-phyCs gene was successfully overexpressed in P. pastoris as an active and extracellular phytase. The yield of total extracellular fusion phytase activity is （25.4±0.53） U/ml at the flask scale and （159.1±2.92） U/ml for high cell-density fermentation, respectively. Purified fusion phytase exhibits an optimal temperature at 55 ℃ and an optimal pH at 5.5-6.0 and its relative activity remains at a relatively high level of above 70% in the range ofpH 2.0 to 7.0. About 51% to 63% of its original activity remains after incubation at 75 ℃ to 95 ℃ for 10 min. Due to heavy glycosylation, the expressed fusion phytase shows a broad and diffuse band in SDS-PAGE （sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）. After deglycosylation by endoglycosidase H （EndoHf）, the enzyme has an apparent molecular size of 95 kDa. The characterization of the fusion phytase was compared with those ofphyCs andphyA^m.     

土曲霉CCTCCAF93044植酸酶基因的克隆及序列分析

参考Hartingsvedt已发表的NRRL3135植酸酶（phyA）基因序列,设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以土曲霉CCTCCAF93044总DNA为模板,扩增出了不包括假定的信号肽序列的phyA基因,并将其克隆到PMD18－T载体上,测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列,该基因全长为1433bp,与已发表的NRRL3135的phyA基因的同源性为97％,编码一个含458个氨基物的蛋白质。     

植酸酶在产蛋鸡饲料中的应用效果试验

一组用植酸酶代替饲料中的全部磷酸氢钙,二组用植酸酶代替饲料中的一半的磷酸氢钙,三组采用基础日粮作为对照组,实验表明,在蛋鸡饲料中可以用植酸酶完全代替无机磷,蛋鸡产蛋性能也有改善,并可降低饲料成本,减少鸡粪便中的磷污染,对生态环境保护具有重要意义。     

植酸酶工程菌产酶条件优化研究

为研究影响植酸酶酵母工程菌的产酶因素，利用摇瓶发酵对毕赤酵母工程菌产植酸酶的最佳甲醇诱导量、诱导时间等因素进行实验分析。结果显示，残留甘油、甲醇浓度、诱导培养时间对植酸酶生产具有重要影响，其中甘油残留会使植酸酶分泌时间延迟，1.5% 甲醇具有最佳诱导效果，在第2天酶活可以达到约1 100 U/mL，低浓度甲醇诱导产酶缓慢积累，而高浓度甲醇对菌体产生毒害。该研究为进一步优化植酸酶工程菌高密度发酵工艺奠定了基础。     

微生物植酸酶对土壤有机磷组分含量及有效性的影响

为提高土壤有机磷素的有效性,并为微生物植酸酶应用于农业生产实践提供理论参考,采用室内培养的方法,研究了不同用量微生物植酸酶菌剂在不同培养时期对土壤有机磷组分含量及有效性的影响.结果表明,添加微生物植酸酶菌剂处理后的土壤活性、中等活性有机磷含量均高于对照,而且与植酸酶菌剂使用量显著相关;其含量随培养时间的延长呈增加趋势,培养至第32d后基本保持平稳;而土壤中稳性和高稳性有机磷含量均低于对照,与植酸酶菌剂使用量显著相关;其含量随培养时间的延长呈减少趋势,培养至第32d后基本保持平稳.添加微生物植酸酶各处理的有机磷总量均低于对照,并随微生物植酸酶添加量的增加而减小;而土壤有效磷含量均高于对照.因此微生物植酸酶可以促进土壤稳定性有机磷向活性有机磷转化,乃至向无机磷转化,从而提高了土壤有机磷素的有效性.     

不同比生长速率对毕赤酵母发酵生产植酸酶的影响

不同比生长速率控制条件下毕赤酵母代谢流流向不同,从而导致产酶量的不同。为了得到毕赤酵母发酵生产植酸酶的最适比生长速率,对毕赤酵母工程菌50 L发酵生产植酸酶的工艺条件进行了研究。结果表明,通过调节甲醇的流加速度,控制菌体比生长速率为0.02 h^-1,发酵结束时,植酸酶酶活17 445 U/mL,比对照提高69.7 %,该比生长速率对发酵生产植酸酶最有利。