增强大肠杆菌MEP2通路发酵生产抗癌药物紫杉醇前体

用合成生物学的方法构建模块,使大肠杆菌遗传背景发生改变,生产红豆杉次生代谢产物紫杉醇前体物质——4(5),11(12)紫杉二烯(Taxadiene)。首先,用基因工程操作手段构建MEP2(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate,2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径)模块,这个模块包括4个基因:ispC、ispE、ispH和ispG,4个基因的表达产物属于大肠杆菌固有途径中的几个酶蛋白;模块构建好后,通过电穿孔的方式把MEP2转化到已含有上游MEP1模块和下游TG模块的大肠杆菌中,改变大肠杆菌固有的遗传信息。再用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导所转入基因的表达,最后用气相色谱-质谱(GC-MS)方法检测表达情况。成功构建MEP2模块;通过与MEP1模块和TG模块的组合实验,MEP2模块能加强菌株表达紫杉二烯。结果表明,微生物大肠杆菌可以通过基因工程改造手段来生产植物天然药物紫杉醇前体物质4(5),11(12)紫杉二烯以及其他中间体。     

植物4CL基因家族结构功能与表达特性研究进展

4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）是植物苯丙烷衍生物,如类黄酮和木质素等,生物合成途径的一种关键酶,在大多数维管植物中4CL基因以基因家族的形式出现.4CL基因家族成员在植物组织中存在差异表达,并参与不同的苯丙烷类衍生物的生物合成.从4CL酶的基因结构、基因家族组成与表达特性等方面详细论述了当前最新研究进展,这将有助于更好地理解植物4CL基因参与苯丙烷类衍生物途径的合成与代谢机制.     

毛白杨4CL基因启动子的克隆及初步功能分析

4CL(4-coumarate:CoA ligase,4-香豆酸:辅酶A连接酶)在植物木质素合成途径中催化羟基香豆酸生成羟基肉桂酰CoA,主要在木质部中表达,对植物木质素生物合成具重要调控作用.为研究4CL基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程研究中的潜在应用价值,利用PCR方法从毛白杨基因组DNA中扩增得到了4CL启动子片段.序列分析表明与美洲山杨(P.tremuloids)的4CL启动子同源性为95%.采用生物信息学方法对该序列进行分析.与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的瞬时表达检测可见明显GUS活性.     

功能模块的集成与测试研究

谷氨酸棒杆菌作为棒杆菌中的模式生物,拥有多条完整的芳香化合物代谢途径,全基因组测序的完成为在谷氨酸棒杆菌中进行代谢调控研究提供了良好的生物信息学平台;该菌包括基因敲除及互补在内的遗传操作系统非常成熟,是研究芳香化合物代谢调控机制的良好模型。该研究旨在利用棒杆菌等模式生物中的莽草酸合成及芳香化合物代谢相关元件进行元件适配性研究,同时结合生物信息学、分子生物学及生物化学方法发掘其他微生物中这两类元件,并对元件进行表征、改造及标准化并建立元件库;选取高效能的功能元件拼接组装为功能模块,并在棒杆菌等底盘细胞中进行检测适配性,从而构建出高效合成以莽草酸为代表性芳香化合物的人工细胞。到目前为止,研究工作完成了谷氨酸棒杆菌莽草酸合成途径酶元件的鉴定,重点完成了谷棒DAHP合酶和分支酸异构酶功能表征及元件间适配性关系,获得大量潜在的莽草酸合成相关代谢元件;并对部分代谢元件进行功能验证和表征;同时建立高效蛋白表达及酶活测定体系。鉴定了谷棒莽草酸途径的7个酶以及分支酸异构酶,完成了谷棒DAHP合酶、分支酸异构酶、脱氢奎尼酸脱水酶以及莽草酸激酶功能表征,揭示了DAHP合酶和分支酸异构酶相互作用机理和调控关系。获得了3 549个莽草酸途径相关基因序列,确定了516个合成目标基因,完成了这些基因密码子优化和基因序列重新设计,选取了37个脱氢奎尼酸脱水酶基因人工合成,构建标准元件库,并表征了它们的酶促动力学参数。构建并验证了快速高通量的筛选—优化—合成—表征莽草酸途径元件库的Pipeline。另外在调控元件库构建方面,构建了包括RBS、Promoter、Terminator以及Insulator等4类共226个元件的调控元件库,为莽草酸通路模块的优化和精细调控的奠定了基础。模块的组装和优化方面,构建了基于Ribo J Insulator的基因表达定量调控模型,合成了莽草酸本地途径酶元件和调控元件元件进行模块组装,并在底盘细胞谷氨酸棒杆菌中实现了表达,对最优配比进行了初步筛选,将莽草酸产量提高了7倍。     

重组毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶催化不同肉桂酸衍生物的酶促动力学研究

4-香豆酸:辅酶A连接酶是杨树木质素合成途径的关键酶之一,催化维管植物木质素合成羟基肉桂酸及其衍生物辅酶A酯化合物的形成.对毛白杨的重组Pt4CL1蛋白的不同肉桂酸衍生物底物的酶促动力学进行了分析,Pt4CL1对肉桂酸、4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸具有催化活性,其中的4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸,Km(μM)值分别为55.02±3.5、52.94±6、44.62±4,Vmax(nM.S-1)值分别为4.23±0.27、4.12±0.11、2.16±0.07;4-香豆酸,咖啡酸,阿魏酸的Kcat(S-1)值分别为44.73×10-3、43.57×10-3、7.61×10-3;对4-香豆酸,咖啡酸,阿魏酸的Kenz(M-1.S-1)值分别为823、812.98、170.55.Pt4CL1对肉桂酸的催化能力很弱,而对芥子酸没有催化活性.结果表明,Pt4CL1对4-香豆酸的催化效率最高,对咖啡酸的催化效率略低于4-香豆酸,而对阿魏酸的催化效率最低,对咖啡酸的催化效率略有很高的转化效率.     

石斛碱生物合成途径及萜类化合物CYP450酶的研究进展

为了对石斛碱生物合成途径进一步解析,对石斛碱生物合成途径研究进展、5 种药用萜类生物 合成的 CYP450 酶功能、CYP450 酶研究手段三个方面进行文献综述。 通过综述石斛碱生物合成研究进展, 提出 CYP450 酶在石斛碱合成途径中羟基化中间体的作用;总结对药用萜类青蒿酸、丹参酮、鼠尾草酸、人参 皂苷、甘草甜素等合成途径中 CYP450 酶的功能研究与鉴定,发现 CYP450 酶在萜类化合物中的主要功能为 羟基化、酮基化等氧化功能;总结 CYP450 酶的研究手段:一方面基因的筛选可以通过数据库检索或植物组 织、多因子诱导表达差异筛选,另一方面基因的表达和功能鉴定通过基因工程的多种手段,转入原核或真核 宿主细胞中表达出酶蛋白,然后加入底物鉴定其催化活性。 最后,展望下一步石斛碱生物合成 CYP450 酶的 挖掘,认为可以通过已有的转录组中筛选出差异 CYP450 酶基因并进行蛋白表达,然后通过上游酶催化或从 植物中分离纯化的方式获得底物,从酶蛋白与底物的催化挖掘与石斛碱合成相关 CYP450 酶类。     

钱塘江流域方形环棱螺的分布及其与水环境相关性的研究

作为一种环境指示生物,方形环棱螺在监测钱塘江水环境状况中有重要的意义.为了解钱塘江不同流域方形环棱螺种群密度与其生存水域水质状况之间的关系,于2013年7月采用样带法对钱塘江上游、中游和下游10个采样点方形环棱螺种群密度进行了调查,同时对相关水域水样进行水质状况分析.结果表明,钱塘江流域上游、中游和下游水体中方形环棱螺种群密度的分布存在着显著的差异,上游种群密度最高,中游其次,下游分布最少;钱塘江上游、中游和下游10个采样点不同水质指标有显著差异,水质指标COD、BOD5、氨氮、总磷、六价铬和石油类均是下游中游上游;同时,SPSS软件统计分析表明,方形环棱螺种群密度与水质指标COD、BOD5、总磷和石油类有明显的相关性(p0.05).     

用基因互作网络识别胰腺导管腺癌基因生物标记

胰腺导管腺癌(PDAC)是全球高致死率癌症中的一种.PDAC基因生物标记的识别可以通过构建基因互作网络完成.利用蛋白质互作网络来分析与研究基因表达芯片数据,构建出PDAC基因互作网络并对其划分基因模块,进而筛选出在模块中的PDAC差异性表达基因.通过筛选在癌症样本和正常组织样本中共表达的基因对,并利用STRING蛋白质互作网络评估基因功能相关性,构建出具有PDAC特异性的基因互作网络.利用iNP算法进行网络模块化分,在每一个模块中,模块内基因都具有强的共表达特性和模块功能相关性.通过筛选,获得了34个基因模块,其中20个在癌症样本中表达明显上调,14个在癌症样本中表达明显下调.从这些模块中又筛选出在PDAC样本中表达上调的10个基因生物标记,如DMBT1、DSC3等和表达下调的10个基因生物标记,如DLG5、NRCAM等.     

新功能人造生物器件的构建及集成/人工细胞的代谢网络改造与系统优化

该研究采用合成生物学的理念和方法,结合代谢工程的手段,理性设计、构建、优化了埃博霉素在天蓝色链霉菌和紫杉醇、达玛烯二醇在酵母中的异源合成模块。在该研究中,建立了高通量萜类合成途径分析平台。通过基因替换、蛋白表达水平微调控对大肠杆菌MEP途径进行改造,从而构建适合IPP和DMAPP生产的底盘细胞。今年主要的工作为构建大片段DNA合成与组装技术平台,完成了体外全合成全长的简适线粒体DNA分子并完成了测序鉴定。分析了细胞代谢与线粒体形态的变化规律,为日后开展简适线粒体DNA导入后细胞代谢变化分析提供了技术基础。     

不同花色品种蝴蝶兰花色素苷含量分析及相关基因表达研究

分析红色、黄色、粉紫色和白色蝴蝶兰品种不同开放度的花和叶花色素苷生物合成途径7个结构基因PAL、4CL、CHS、DFR、F3H、F3'5H和ANS基因和3个调节基因的表达.结果显示:10个基因的表达因不同花色、不同发育阶段而异.这10个基因在叶中的表达量相对花较低.黄金甲中PAL、4CL、CHS、F3H、F3'5H基因的表达量均较高,PAL、4CL、CHS和F3'5H在开花期达到峰值,粉色花空港红鹰花DFR、CHS、F3H、F3'5H表达量较高.白色花空港枫叶和黄色花富乐夕阳花中CHS、DFR、F3H、F3'5H和ANS表达量较低.CHS在6个品种花的不同阶段皆有表达.F3H基因在6个品种中表达量较低,与花色素合成不存在直接相关.调节基因b HLH 6个品种各发育阶段的表达量均较高,MYB表达量较低,这些结果表明,蝴蝶兰花色素苷积累是CHS、F3'5H、DFR和ANS等关键结构基因共同表达的结果,编码转录因子b HLH基因的表达可能在花色形成中作用较大.     

杨树木质部特异性定位表达4CL1启动子的结构与表达特性

4-香豆素COA连接酶(4CL1)是木质素代谢途径中的一个关键酶,对该基因启动子的表达特性与调控元件进行了研究:首先,对毛白杨4CL1启动子进行了生物信息学分析,结果表明该启动子包括3个顺式作用元件,box P(CCTTCACCAACCCCC),box A(CCGTTC),box L(TCTCACCAACC),这3个顺式作用元件在已知的木质素代谢途径相关酶系如苯丙氨合成酶(PAI)和4CL中普遍存在;其次,运用PCR方法对该启动子进行了剪切,获得一个长393 bp的启动子片断,该启动子片断包括以上3个顺式作用元件;最后,将该启动子片段与GUS报告基因构建了植物表达载体并转化烟草,成功获得转基因再生苗,结果发现转基因烟草的茎木质部呈现GUS染色阳性.研究结果表明,一个393 bp长度的4CL1启动子片断足以介导外源基因在木质部特异性定位表达.     

基于转录因子信号识别基因的表达水平

真核生物的基因表达调控过程十分复杂,各种转录因子通过与基因上游特异性序列结合协同地对靶基因的表达水平进行调控。以人类GM12878细胞系为研究对象,基于表达谱RNA-seq数据构建了高低表达基因集合,利用74种转录因子(TF)的ChIP-seq峰值数据计算了转录因子和靶基因的关联分数(TFAS),进而根据转录因子间的相关性筛选得到了6个转录因子模块。进一步,通过统计靶基因转录起始位点邻近转录因子结合的信号分布,构建了基于TF信号的卷积神经网络模型(TFCNN)去识别基因的表达水平。结果表明,基因表达水平特异的TF模块能够更好的识别基因的表达水平,且基于高表达特异性模块C构建的TFCNN模型的准确性达到了93.23%。     

林可霉素生物合成基因lmbU的敲除及其遗传回补

利用DNA同源重组原理敲除S.lincolnensis NRRL 2936中lmbU基因,筛选获得该基因缺陷株S.lincolnensis JLUa2,其不具备林可霉素生物合成能力.利用构建的不同重组质粒转化缺陷株,发现含有质粒pHBUYX335的缺陷株重新获得了林可霉素生物合成能力.单一回补下游基因lmbY和lmbX不能使缺陷株重新恢复林可霉素合成能力;而同时回补lmbU基因和下游基因lmbY和lmbX却能回补这种缺陷,缺陷株林可霉素合成能力的丧失不仅是由下游基因的破坏而引起,证实了lmbU基因是林可霉素生物合成的关键基因.根据不同重组质粒上装载的基因片段性质推测了lmbU基因可能的启动子.     

生物处理系统中超声波执行模块的设计

为了实现超声波生物处理频率优化控制系统中最优频率的输出,完成了执行模块的设计。在多频带组合搜索、捕捉锁定最佳处理频率后,基于直接数字频率合成芯片AD9851和ATmega16实现最优频率的合成,设计功率放大和频率跟踪模块以满足驱动需求和谐振工作。实验结果表明,该模块稳定、可靠,能较好地驱动超声波发生装置,跟踪负载谐振的变化,有效抑制功率器件的开关损耗,保证电源效率。     

过量表达EPSPS转基因促进栽培稻与杂草稻杂种后代的叶绿素合成

过量表达内源EPSPS基因不仅能够提高栽培稻对草甘膦除草剂的抗性,还能在不施用草甘膦的条件下提高转基因栽培稻与杂草稻杂种后代的光合速率.由于叶绿素是影响光合作用的关键因子,本研究探索了过量表达EPSPS基因是否提高栽培稻与杂草稻杂种后代的叶绿素含量以及叶绿素合成途径中关键基因的表达.以EPSPS转基因栽培稻(EP_3)及其与杂草稻两个组合的F_3杂种后代分离群体为实验材料,分别测定了含EPSPS转基因和不含EPSPS转基因杂种后代群体的叶绿素含量以及叶绿素合成关键基因的表达量.结果表明,含转基因EPSPS的栽培稻×杂草稻后代群体的叶绿素含量显著增高,在培养至30d的时候,总叶绿素含量分别增高了86.89%和22.58%;培养至60d的时候,总叶绿素含量分别增高了72.82%和51.30%.叶绿素合成途径中的3个关键基因GLUTR、CHLH和PORA的表达显著上调.因此而做出如下结论,EPSPS基因的过量表达可以通过调控叶绿素合成途径中关键基因的表达,促进叶绿素的合成,进而提高了植物光合作用的速率.     

黑河流域地下水电导率空间分异特征及影响因素研究

黑河流域是我国西北干旱区的第二大内陆河流域,地下水电导率γ的研究对保护流域地下水资源,减少流域生态环境的破坏具有重要的现实意义.通过对黑河流域地下水γ的空间变化及其与主要离子的关系进行分析,结果表明:1)整体上,上游浅层及深层地下水γ均较低,明显低于中下游地区,中游浅层地下水γ明显高于深层地下水,下游浅层与深层地下水γ差异不大;2)从区域上来看,中游干流地区浅层地下水γ沿流程呈增加趋势,中、下游沿河道附近浅层地下水γ高于距河道较远地区,上游及中游山前平原地区深层地下水γ较低,明显低于中游细土平原地区,下游居延海—中蒙边界地区与狼心山—额济纳旗城河道附近地区的深层地下水γ存在明显差异;3)地下水γ与各主要离子的关系表明,上游山区地下水γ主要受到Na~+、Cl~-浓度的影响,中、下游地区地下水γ主要受到Na~+、Cl~-和SO_4~(2-)浓度的影响.此外,中游距河道较远地区的深层地下水γ以及下游沿河道附近的浅层及深层地下水γ均受到了农业灌溉活动的影响.     

利用番茄U3snRNA基因上游启动区构建植物表达载体及对烟草的转化

利用番茄U3snRNA基因上游启动区和ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因DNA片段,构建含U3snRNA基因上游启动区-ACC合成酶的反义RNA-核酶嵌合序列的表达载体,重组于植物双元表达载体pGA643中,得到pGU3R.用三亲融合法导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化烟草,诱导再生小植株,获得了卡那霉素的抗性植株.提取抗性植株总DNA,通过PCR、PCRSouthern杂交检测并分别用启动区序列和ACC合成酶的反义RNA-核酶嵌合序列作探针,通过Southern杂交检测,已筛选出整合有外源基因的转化植株.为进一步研究U3snRNA上游启动区增强反义RNA-核酶基因的表达奠定了基础.     

茎瘤芥根和茎组织转录组比较分析

茎瘤芥是十字花科芸薹属植物的变种.本研究在前期的转录组测序和数字基因表达谱(DGE)测序的基础上进一步对榨菜的根组织进行了测序和分析.通过高通量RNA-Seq测序我们获得了高质量的数字基因表达谱数据超过一千万条,其中有约71%能比对到参考基因序列上.我们将根组织的数字基因表达谱数据与榨菜瘤茎膨大过程中的3个时期的数字基因表达谱数据进行了比较,获得了共有的(3组差异表达基因的交集)差异表达基因共3594个,对这些差异表达基因的表达趋势可以分为8个簇.同时对这些差异基因进行代谢途径的功能注释,发现这些差异表达基因除了在光合作用相关的途径外,主要分布在细胞壁的合成、降解以及二级代谢如类黄酮代谢等途径方面.通过对榨菜根组织的转录组测序,我们筛选得到了部分榨菜根与茎的差异表达基因,这些基因可能与榨菜的瘤茎膨大有关.     

3个甘蔗品种（系）响应低温胁迫的转录组分析

权重基因共表达网络分析( weighted gene co-expression network analysis， WGCNA) 可通过聚类鉴定共表达的基因模块来研究生物学数据与相应性状之间的关系。为了挖掘甘蔗响应低温的特异基因，揭示甘蔗响应低温的分子调控机理，本研究以3个耐寒能力不同的甘蔗品种作为试验材料，利用转录组测序技术分析不同抗性甘蔗品种在低温胁迫（4℃）下基因表达。研究结果表明，WGCNA鉴定出13个基因共表达模块，通过相关性分析筛选到blue和yellow模块作为甘蔗抗寒机理研究的目标模块。基于blue和yellow模块中筛选关键基因，以及筛选抗寒品种中特异表达基因，最终筛选出13个基因可能与甘蔗抗寒能力密切相关，为后续选育耐寒性强的优良甘蔗新品种提供理论依据和技术支撑。     

大肠杆菌丁醇生产菌的构建及检测

用合成生物学和代谢工程技术,筛选并克隆丁醇合成途径中酶活性较高的atoB,hbd,crt,ter,adhE2等5个关键酶基因,先通过重组PCR构建pUC18-ato B-hbd-crt-ter质粒,再将串联基因atoB-hbd-crt-ter和基因adhE2克隆至质粒pET-21b中,构建含丁醇合成途径的表达载体p ET-21b-ato B-hbd-crt-ter-adh E2,将其转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中制备工程菌株.对样品进行IPTG诱导表达检测与色谱分析的结果表明,已合成出关键酶蛋白并产生一定量的丁醇.