蟾蜍(Bufo japonicus)细胞溶素基因筛选用探针的制备

利用阴离子交换、凝胶过滤和高压液相柱层析对细胞溶素基因进行了纯化,获得了纯度极高的酶样品．经ｌｙｓｉｌ 内肽酶进行定点酶切后,利用高压液相柱层析纯化出了该酶的多个短肽片段．其中,经测序获得了３ 个短肽片段的氨基酸序列．根据两栖动物中密码子的使用频率,可推测出其相应ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的核苷酸序列,进而制备出了３ 个ｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针．利用这些合成的探针,便可从精子ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库中筛选细胞溶素基因．     

环状芽胞杆菌基因启动子的分离与鉴定

环状芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）总ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ酶切后插入到启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１的ＢａｍＨＩ位点，转化大肠杆菌后，在卡那霉素的平板上筛选到５０个抗性菌落。从随机挑取的２９个抗住菌落所分离到的质粒ＤＮＡ经限制酶切和琼脂糖凝胶电泳后表明，各质粒均有ＤＮＡ插入片段，对２９个样品进行卡那霉素抗性试验显示，抗性最高的可超过１０００μｇ／ｍＬ这表明来自环状芽胞杆菌的某些基因启动子能在大肠杆菌中十分有效地启动基因表达，选取两个最大的克隆ＤＮＡ片段ＢＣ３和ＢＣ６作为探针与Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２．总ＤＮＡ作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，均获得杂交带。斑点杂交结果表明，这两个ＤＮＡ片段来自不同的基因启动子。对ＢＣ６和ＢＣ３分别进行了限制酶谱分析，并绘制了限制酶图。     

129小鼠CgA基因cDNA5‘端部分片段及CgA基因的克隆

通过ＲＴ－ＰＣＲ方法,从１２９小鼠脑组织中克隆到ＣｇＡ基因ｃＤＮＡ５‘端部分片段,序列分析结果表明：所克隆到的片段序列与文献中完全一致,以此片段为探针,从１２９小鼠基因组库中筛选获得阳性噬菌体１－１,克隆了ＣｇＡ基因,并与文献中的小鼠ＣｇＡ基因限制性内切酶图谱进行了比较分析。     

人粒细胞集落刺激因子cDNA的克隆与表达

用脂多糖诱导正常人单核细胞使产生粒细胞集落刺激因子。从诱导细胞中提取出总ＲＮＡ，以特上物经逆转录ＰＣＲ扩增出粒细胞集落刺激因子ｍＲＮＡ和ｃＤＮＡ，将其插入经改造的分泌型表达载体ｐＩＮ－ｏｍｐ Ａ，并转化受体菌Ｅ．ｃｏｌｉ。克隆的ｃＤＮＡ通过限制性酶双酶切的３＇端、５＇端及中间序列探针分子杂交鉴定，结果与预期一致。表达质粒在大肠杆菌哟ＩＰＲＴＧ诱导，粒细胞集落刺激因子被分泌到细菌的周质中。产物提取后     

用复制酶基因cDNA探针检测表达病毒外壳蛋白基因马…

利用马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）复制酶基因３＇端长约６００ｂｐ的ｃＤＮＡ，用缺口平移方法进行＾３２Ｐ同位素标记，制备成ｃＤＮＡ探针，通过核酸斑点杂交，对提纯的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）、病毒ＲＮＡ、ＰＬＲＶ感染的马铃薯汁液，表达ＰＬＲＶ ＣＰ基因的马铃薯叶片及块茎芽进行了检测。结果表明，＾３２Ｐ标记的复制酶基因ｃＤＮＡ探针特异性强、灵敏度高。可测得提纯病毒的最低含量为４０８ｎｇ／ｍｌ，病毒ＲＮＡ最低     

花生根瘤菌基因组文库的构建

以具有高吸Ｈ２活性的花生根瘤菌Ｌ８－３为出发菌株提取总ＤＮＡ，经ＢａｍＨＩ不完全酶切后，获得２０ｋｂ左右的ＤＮＡ片段，按Ｉｓｈ－Ｈｏｒｏｗｉｃｚ和Ｂｕｒｋｅ方法，与具有多克隆位点的ＣｏｓｍｉｄｐＬＡＦＲ３克隆载体连接，经体外包装、转导Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１，在选择培养基平板上获得１万多个重组克隆子．随机挑选２２个克隆子进行分析，其中１９个克隆子携带外源ＤＮＡ片段，平均长度为２１．４ｋｂ，文库有效克隆子数和插入ＤＮＡ片段均达到建库要求．ＰＣＲ筛选和生物素探针杂交初步结果显示，重组质粒中所携带的外源ＤＮＡ可能含有我们所需的吸Ｈ２基因．     

人胰岛素原乳腺表达载体的构建

通过ＰＣＲ方法扩增了人胰岛素（ＨＩ）基因１．３４ｋｂ的ＤＮＡ片段并克隆于ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点内。经ＤＮＡ序列分析表明，该片段为ＨＩ基因的氨基酸编码区及３＇端调控区序列。同时，应用ＰＣＲ方法对牛α－乳白蛋白（ＢαＬＡ）基因进行了扩增，得到了０．８４ｋｂＤＮＡ扩增片段。将其克隆于去除了ＥｃｏＲＩ位点的ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点内，经内切酶分析和ＤＮＡ测序证明该片段是ＢαＬＡ基因５＇调控区序列。ＥｃｏＲ     

豌豆cop1cDNA的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以拟南芥ｃｏｐ１ｃＤＮＡ为探针,从豌豆ＣＤＮＡ文库中克隆到了豌豆ｃｏｐ１ｃＤＮＡ。序列分析表明,它全长为２８６３ｂｐ,其中包括６０４ｂｐ５‘非编码区,２４３ｂｐ３’非编码区和２０１６ｂｐ编码区,编码６７２个氨基酸。在大肠杆菌中实现了豌豆ｃｏｐ１基因的高效表达。对拟南芥、豌豆和番茄３种植物ｃｏｐ１的序列同源性比较表明,ｃｏｐ１可能是一种进化上很保守的蛋白质。     

盐藻磷酸甘油脱氢酶基因cDNA文库的构建

采用Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１０载体构建了盐藻ｃＤＮＡ文库，文库大小为１０＾６／ｍＬ插入片段平均长度大于１ｋｂ。根据果蝇，兔，鼠编码其３－磷酸甘油脱氢酶基因的辅酶ＮＡＤ的结合功能区保守序列设计一对引物，大小分别为２１ｂｐ和１８ｂｐ。ＰＣＲ扩增得到与果蝇相同的２９０ｂｐ特异扩增片段，以该片段为探针，采用缺口平移系统标记原位杂交，从盐藻ｃＤＮＡ文库中获得３６个３－磷酸甘油脱氢酶基因的阳性克隆。     

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同源DNA片段的克隆

利用作者克隆的酿酒酵母基因启动子片段Ｙ８为探针和菌落原位杂交方法，从构建的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＮＮ２７基因组文库中共筛选８个阳性克隆。根据这些克隆中插入片段大小和限制酶切结果，可将其划分为６种，分别命名为ＹＮ１－ＹＮ６．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，这６种ＤＮＡ片段不仅能与６．５ｋｂ的全长Ｙ８探针我，而且均能与ＰｓｔＩ酶切Ｙ８所得的３段ＤＮＡ探针杂交。     

人18周胎儿脑cDNA文库的构建及鉴定

许多脑基因的特异性表达对人脑的发育，分化有着重要的作用，为了研究这些基因的结构和功能，构建了一个人１８周胎儿脑ＣＤＮＡ文库，抽提总ｍＲＮＡ后，经过一系列的酶促反应合成ｃＤＮＡ，分有分离柱除去小片段后克隆到λｇｔ１０载体中，转染宿主菌Ｃ６００ｊｆｌ后文库包装效率为４．６×１０＾６ｐｆｕ／μｇ，ｃＤＮＡ平均郫在于１．２ｋｂｐ已知序列设计引物，从ｃＤＮＡ文库中扩增出神经生长因子（ＮＧＦ）的生长编码基因     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

人C2H2型锌指蛋白基因ZNF194全长cDNA的克隆

用一个含有锌指编码序列的人ｃＤＮＡ片段（Ｌ２￣９）作为探针杂交筛选人肝组织ｃＤＮＡ分子库，得到８个杂交阳性克隆，经测序和拼接后，将其整合为一条长１８３８ｂｐ和ｃＤＮＡ序列，该序列的２２１￣１６４２ｂｐ为一个完整的开放阅读框，编码了一个由４７３个氨基酸组成的蛋白质，１￣２２０ｂｐ为５′－ＵＴＲ，１６４３￣１８３８ｂｐ为３′－ＵＴＲ，在１８０１￣１８０６ｂｐ有一个加尾信号序列ＡＡＴＡＡＡ，３′端为１８     

家蚕核型多角体病毒gp64基因的定位及克隆

以苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒ＡｃＭＮＰＶ的膜表面糖蛋白基因ｇｐ６４作为探针，对经不同内切酶酶切的家蚕核型多角体病毒基因组ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，发现ＢａｍＨⅠ酶切产生的４．２ｋｂ和７．６ｋｂ片段呈阳性杂交，经ＤＮＡ片段回收，将４．２ｋｂ片段进行了克隆     

中国人群DMD基因含外显子片段的限制性带型和RFLPs研究（Ⅰ）：Bgl…

采用ＤＭＤ基因的全长ｃＤＮＡ（１４ｋｂ）为杂交探针，分析了中国人群ＤＭＤ基因含外显子片（ｅｘｏｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）的ＢｇｌⅡ限制性片段和ＲＦＬＰｓ。新揭示出四个ＢｇｌⅡ片段，ＤＭＤ基因全长范围内含外显子的ＢｇｌⅡ限制性片段总数至少为５９个，这为制作ＤＭＤ基因的ＢｇｌⅡ部分限制图奠定了重要基础；另分析了四个ＢｇｌⅡＲＦＬＰｓ在中国人群中的等位频率，在ｃＤＮＡ２ｂ－３，ｃＤＮＡ     

人ZP3B-细胞表位嵌合肽DNA的设计和合成

目的：设计和合成适合在昆虫细胞中表达的一个人ＺＰ３ Ｂ细胞表位的ＤＮＡ序列。方法：根据国外的研究基础，设计由人ＺＰ３的Ｂ细胞表位肽段和外源Ｔｈ细胞表位肽段串联而成的４５肽嵌合肽序列，并根据昆虫细胞对密码子的偏爱性设计出该嵌合肽的ＤＮＡ序列。然后人工合成该嵌合肽的ＤＮＡ链，并克隆到ＰＵＣ１８载体上。结果：通过酶切分析和测序证明，合成的ＤＮＡ与所设计的嵌合肽ＤＮＡ序列一致。结论：按设计合成了人ＺＰ３的     

中国人CD59 cDNA克隆,序列分析及其表达

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从中国人胚胎总ｍＲＮＡ中扩增出４２０ｂｐ人补体终末阶段同源限制因子（ＣＤ５９）的ｃＤＮＡ，序列分析结果表明，所获得的ＣＤ５９ ｃＤＮＡ与文献报道中的基因序列完全一致，含ＣＤ５９全长编码区，构建了真核表达质粒，在３Ｔ３细胞中得到了表达。     

植酸酶基因表达与调控机制研究(Ⅱ)──番茄幼苗cDNA文库构建与植酸酶基因筛选

采用异硫氰酸胍法从发芽３～４ｄ的番茄幼苗中提取出总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素亲和层析分离纯化ｍＲＮＡ．以ｍＲＮＡ为模板,Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物用逆转录法合成双链ｃＤＮＡ．将ｃＤＮＡ与ＥｃｏＲＩ接头连接后克隆到表达载体λｇｔ１１的单一ＥｃｏＲＩ位点,经体外包装后感染宿主菌Ｙ１０９０,成功地构建了完整的番茄幼苗ｃＤＮＡ文库．用颜色筛选法筛选重组子,然后用植酸酶抗体做探针进行免疫筛选,得到两个阳性克隆．挑取阳性克隆噬菌斑扩增后纯化ＤＮＡ,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,显示确有外源ＤＮＡ存在．该插入片断序列测定正在进行．     

牛酪蛋白cDNA基因克隆的改建

牛酪蛋白全长ｃＤＮＡ克隆ｐＢａＳ１ｃ１８４Ｘ ＧＬⅢ和ＣＯｒＩ双酶切，回收基中的酪蛋白基因编码片段，与经ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ双酶切的植物表达载体ｐＢＩ１２．１２分两步连接；第一步载体的ＢａｍＨＩ末端与酪蛋白基因的ＢｇｌⅡ粘性末端连接；第二步用Ｔ４ＤＮＡ多聚酶补平酪蛋白基因的ＥｃｏＴＲⅠ末端，再与载体ＳｍａⅠ进行平末端连接而环化。     

豌豆中GPAT基因编码cDNA的克隆及分析

参照国外报道的豌豆ＧＰＡＴ基因ｃＤＮＡ序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，通过ＲＴＰＣＲ技术，从云南地方栽种的豌豆品种中分离到了ＧＰＡＴ基因的编码ｃＤＮＡ片段，并将其纯化后直接克隆到ｐＧＥＭＴ载体系统中，经ＮｃｏⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切鉴定，所得的重组质粒中含有１３８０ｂｐ左右的片段．采用ＰｓｔⅠ，ＨｉｎｄⅢ两种限制性内切酶进行酶切，酶切图谱分析表明所克隆的豌豆ＧＰＡＴ基因编码ｃＤＮＡ的酶切图谱与国外所报道的该基因ｃＤＮＡ的酶切图谱一致，暗示了该基因在进行上具有一定的保守性．