海水养殖真鲷肝CYP1A基因的克隆与表达

根据国外已发表野生真鲷(Pagrus major)肝CYP1A cDNA同源序列,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从我国海水养殖真鲷(Pagrus major)的肝脏中扩增出P4501A基因全长cDNA序列(1 548 bp).用基因重组技术将P4501A cDNA克隆于pTrc-CKS载体,在大肠杆菌TOP10F′诱导表达,将细菌总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析;其表达产物为89 ku,获得了表达融合蛋白CKS-CYP1A.该项研究将为利用免疫学技术研究有机污染物的毒性效应机制以及探讨P450酶作为毒性效应的生物标志物奠定基础.     

花椰菜（Brassica oleracea vat．botrytis）抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731（感病系）和C712（抗病系）作为材料,利用cDNA—AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况．获得了两个阳性克隆M2和M6．Northern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同．而M6是差异表达的cDNA片段．Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列．随后的序列分析发现M6cDNA片段与拟南芥1号染色体的BACF19P19中66665～66813bp有84％同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列．推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91％同源性．用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现：M6cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势．根据序列分析和初步的功能分析的结果推测：M6cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段．是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段．     

苯并[a]芘(BaP)对真鲷细胞色素P450和芳香烃受体基因表达的影响

通过水体暴露方式对海水养殖真鲷进行BaP持续染毒,利用实时定量PCR技术研究了真鲷细胞色素P450基因(CYP1A1)和芳香烃受体基因(AhR2)随BaP暴露剂量、时间的动力学变化.结果发现,0.1～1.5 μg/L环境浓度的BaP能够显著性诱导CYP1A1基因和AhR2基因的表达,且AhR2 mRNA早于CYP1A1 mRNA被诱导表达;BaP持续暴露48 h,CYP1A1和AhR2基因的表达水平均随暴露时间的延长而显著升高,染毒72 h后又回复到本底水平,实验表明这两个基因的表达与BaP的暴露剂量和暴露时间之间具有显著性的剂量-效应和时间-效应关系.     

苯并〖DK(〗［a］芘(BaP)〖DK)〗对真鲷细胞色素P450和芳香烃受体基因表达的影响

 通过水体暴露方式对海水养殖真鲷进行BaP持续染毒,利用实时定量PCR技术研究了真鲷细胞色素P450基因(CYP1A1)和芳香烃受体基因(AhR2)随BaP暴露剂量、时间的动力学变化。结果发现,01～15 μg/L环境浓度的BaP能够显著性诱导CYP1A1基因和AhR2基因的表达,且AhR2 mRNA早于CYP1A1 mRNA被诱导表达;BaP持续暴露48 h,CYP1A1和AhR2基因的表达水平均随暴露时间的延长而显著升高,染毒72 h后又回复到本底水平,实验表明这两个基因的表达与BaP的暴露剂量和暴露时间之间具有显著性的剂量-效应和时间-效应关系。     

棉纤维细胞色素单加氧酶基因GhCYP714A1促进活性氧的累积

本研究利用RT-PCR技术从陆地棉纤维组织中克隆得到了1个棉花细胞色素P450基因(Cytochrome P450714A1)的全长c DNA序列,将该基因命名为GhCYP714A1。序列分析发现,该cDNA包含1563 bp的完整开放读码框,编码521个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为57.31 kDa;氨基酸序列生物信息学分析显示,Gh CYP714A1蛋白具有跨膜结构域和多个蛋白结合位点;进化树分析结果表明,棉花Gh CYP714A1与禾草SiCYP714B1在进化上亲缘关系上较近;半定量RT-PCR的组织表达特异性分析表明GhCYP714A1基因与纤维突起形成发育有关。本研究构建了pET28a-GhCYP714A1原核表达载体并进行体外诱导表达,获得分子质量约为57.31 kDa的重组蛋白。将GhCYP714A1基因转化烟草验证其参与活性氧产生的功能,与非转基因的野生型烟草相比,转基因烟草叶片中具有较高的H_2O_2累积。本实验结果为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础。     

金鱼蛋白磷酸酶2A—B＂家族Alpha和Gamma调节基因的cDNA克隆及mRNA表达

以金鱼卵巢组织作为材料,运用RTPCR和cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆得到蛋白磷酸酶2A（PP2A）调节亚基B＂家族中γ基因（GSPR）cDNA全序列和α基因（PR130）cDNA部分序列．结果显示γ基因cDNA全长1885bp,编码一个含457个氨基酸的蛋白质．而α基因cDNA长1781bp,编码的多肽共含426个氨基酸,系v亚基的部分蛋白序列．它们与已知其他物种对应的B＂家族蛋白质均有着很高的同源性．结构预测分析发现,α和γ两条多肽均存在PP2A调节亚基B＂家族成员共有的两个EFHAND结构域．用RT—PCR的方法检测了这两个基因在金鱼不同组织和胚胎发育不同时期的mRNA表达水平．结果表明,γ亚基在金鱼多种组织和各个胚胎发育时期中均有较高表达且表达量比较平均,仅在卵巢和精巢组织中最为丰富．与γ亚基表达模式相比,α亚基表达呈现明显的组织和胚胎发育阶段差异性,在卵巢和肌肉组织中最高,在肾脏和鳃中最低,在原肠胚、神经胚、脑泡分化和体色素等胚胎发育时期的表达较弱,而在其他时期中的表达较强．据此,推测α、γ两调节亚基可能在金鱼不同组织和胚胎发育过程中起着特定的作用．此外,进一步的分析发现,α基因除参与PP2A全酶功能外还可能具有独立的功能．     

苯并（a）芘对真鲷胚胎EROD活性影响的测定

为测定真鲷（Pagrus major）胚胎CYP1A活性（ethoxyresorufin-o-deethylase,EROD）对于BaP暴露的响应,将受精两天后的真鲷胚胎暴露于不同浓度的BaP（0.5,0.8,1.2,1.8μg/L）,采用一种对胚胎个体无损伤的方法测定胚胎EROD活性.结果表明真鲷胚胎EROD活性在BaP浓度为0.8μg/L时已经开始被诱导,活性最大值出现在最高浓度组1.8μg/L最高浓度组EROD活性值是对照组的4倍.从EROD活性对不同浓度BaP暴露的响应来看,真鲷胚胎EROD活性与BaP浓度有着明显的剂量效应关系,随着BaP浓度的升高EROD活性呈正相关上升,证实胚胎EROD活性可以做为BaP暴露的敏感生物标志物.     

蜡梅热激蛋白基因 Cp HSP70-1的克隆、亚细胞定位与表达分析

在已构建的蜡梅花转录组数据库EST序列分析的基础上,采用 RACE技术克隆获得蜡梅热激蛋白 HSP70的cDNA序列,命名为CpHSP70‐1（GenBank登录号：KR071130）．该序列全长2520 bp ,包括1962 bp的完整开放阅读框,编码653个氨基酸蛋白序列,含有3个 HSP70家族典型基序．CpHS P70‐1蛋白与其他真核生物的HSP70蛋白具有较高的同源性,聚类分析显示其属于定位于细胞核／细胞质的蛋白．亚细胞定位结果支持该蛋白分布于细胞核的预测．利用实时荧光定量PCR对 CpHS P70‐1基因的表达特性进行分析,其在各组织中均有不同程度的表达,其中在成熟叶片中表达量最高;在不同花发育阶段呈现持续稳定的表达模式;该基因在低温和高温诱导下表达量提高,而且对高温的响应更为敏感．     

HPV16 E6基因真核表达载体的构建

本研究目的是构建HPV16 E6真核表达载体，为细胞转染研究E6蛋白和p53Arg或p53Pro蛋白的相互作用以及作用后对细胞功能的影响奠定基础。应用PCR技术从质粒pSP64-HPV16 E6上扩增出HPV16 E6片断。根据Kozak序列对真核蛋白表达的影响，设计2条引物扩增出2个HPV16 E6目的片断均插入真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A中，构建pcDNA3．1／myc-His（-）A．HPV16 E6重组质粒。研究结果显示：经酶切和测序鉴定克隆的基因片段为HPV16 E6 cDNA；建立了pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6重组质粒。这表明，已成功构建HPV16 E6真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6。     

人乳铁蛋白(hLF)cDNA的克隆及序列分析

从正常人外周血中分离中性粒白细胞（WBC），提取总RNA，用RT—PCR的方法扩增人乳铁蛋白（hLF）cDNA．cDNA分hLF1．5、hLF0．8两段扩增并连入pMD18-T载体上，再利用限制酶连入巴氏毕赤酵母表达载体pPICZα—A中，构成完整的hLF基因．序列测定表明，所克隆的hLF基因序列全长为2，136bp，与Gene Bank中登录的序列相比，同源性达99％以上．     

藻蓝蛋白裂合酶突变体的构建及其对催化功能的影响

在序列分析的基础上，使用PCR技术构建了藻蓝蛋白裂合酶CpcE／CpcF基因的缺失突变体：cpcE（42～276）、cpcE（1～274）、cpcE（1～272）、cpcF（1～160）、cpcF（10～213）．突变体基因克隆至表达载体pET 30a（＋）后，利用体外重组实验对表达蛋白的酶活性进行了研究．揭示了缺失区域在酶催化过程中的作用．     

苜蓿花叶病毒复制酶基因全长cDNA植物表达载体的构建

将苜蓿花叶病毒中国分离株（Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，AlMV-Ch）的复制酶P2亚基（90KD蛋白）基因的全长cDNA构建到植物表达载体pROK Ⅱ中，得到重组植物表达载体pAlMV-FL．     

苹果褪绿叶斑病毒库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因的序列分析

利用RT-PCR，获得苹果褪绿叶斑病毒库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因的cDNA克隆。序列分析结果表明，库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因由582个核苷酸组成，编码一个由193个氨基酸组成的蛋白质。与已报道的P863、P205、A-Ball分离物序列比较，核苷酸序列同源性为80．0％～86．1％，推导的氨基酸序列同源性为84．9％～89．6％。     

蝴蝶兰查尔酮合酶基因cDNA的克隆、鉴定及其原核表达

利用逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在蝴蝶兰花瓣中特异性表达的查尔酮合酶cDNA(pchs-1)．DNA序列分析表明,该序列与已发表的查尔酮合酶基因有很高的同源性．将此cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET-24α( )原核表达载体上,经IPTG诱导后,SDS-PAGE的结果表明有预测大小的蛋白受诱导表达,该基因在植物中的功能验证工作正在进行中．     

鳜鱼（S．Keneri）肌球蛋白重链基因cDNA的克隆及其特征分析

鳜鱼（S．Keneri）以优良肉质性状成为极具商品价值和大力推广人工养殖名贵鱼类之一．为掌握控制优良肉质性状的遗传基础,采用同源克隆RT-PCR方法,克隆出该鱼肌球蛋白重链（MYH）cDNA序列．该基因cDNA序列全长5938bp,编码区长度为5814bp,含有poly（A）信号,3’非翻译区长124bp,其开放阅读框共编码1938个氨基酸,推算蛋白质分子质量为221．6Ku．鳜MYH基因由3个结构域组成,即MYSc-type-Ⅱ,SMC-N和Myosintail1,其中MYSc-type-Ⅱ头部结构与鲤、斑马鱼同源性达90％,具高度保守性．通过DNAstar软件MegAlign构建进化树显示不同物种间该基因核苷酸编码序列同源性为77％86％,氨基酸编码序列同源性达80％-92％．采用RT-PCR方法研究MYH在不同发育阶段差异表达结果表明,MYH在肌肉效应期开始有低量表达,成鱼期和鱼苗期表达量高,而囊胚期与神经胚均未表达．由此推测MYH基因于肌肉效应期开始表达．研究结果揭示鳜鱼肌球蛋白重链基因在进化上保持与其他脊椎动物相似性和差异性,为决定名贵鱼类肉质结构基因的研究提供了分子生物学基础．     

泛素和PR1a信号肽融合基因植物表达载体的构建

泛素（Ubiquitin）融合蛋白策略在近年来已被应用于在植物中提高外源蛋白的产量。信号肽（Signal Peptide）使外源蛋白定向运输到细胞内的特定部位。本研究是在植物高效表达载体pBin438的基础上，采用三引物PCR法（TP-PCR）技术，将拟南芥（Ambidopsis）泛素基因与烟草病程相关蛋白PR1a基因的信号肽序列体外重组；并将重组的融合基因定向克隆到植物表达载体pBLG中，获得了含有泛素和PR1a信号肽序列的植物表达载体pBLG-UP。这为进一步验证外源基因在植物体内的高效表达奠定了基础。     

人Rab26基因的克隆和表达

以完整EST为参考序列设计引物,以人的胎脑cDNA为模板,用PCR方法筛选获得Rab26基因全长序列,并亚克隆到载体pGEM-T,真核表达载体pEGFP-N1和原核表达载体pET．32a（＋）中,RT-PCR显示该基因在不同组织的肿瘤细胞株中表达量有明显的差异．把Rab26基因转染入HeLa细胞中,通过与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达,显示Rab26定位于胞内膜性细胞器上．在大肠杆菌表达系统获得Rab26基因的高表达．这些结果为进一步研究Rab26基因在细胞内吞和运输功能等方面打下了基础．     

hIL-10在大肠杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

构建了含有人白细胞介素-hIL-10（Human Interleukin10，hIL-10）基因的重组质粒，在大肠杆菌中的高效表达，并对其生物学活性进行了鉴定．用RT-PCR扩增hIL-10 cDNA，并插入原核表达载体PET-32b．将重组质粒转入BL21（DE3）感受态细胞，在37℃用IPTG诱导hIL-10表达．表达的重组蛋白经复性纯化后，用夹心ELISA法检测其对外周血单核细胞（PBMC）合成IFN-γ的抑制作用．重组质粒PET-32b／hIL-10的DNA序列分析显示，克隆的DNA序列和文献报道的hIL-10 cDNA序列一致．SDS-PAGE表明，重组蛋白相对分子质量为18000．活性测定结果显示，重组蛋白能显著抑制PBMC合成IFN-γ．这表明构建的PET-32b／hIL-10可以在大肠杆菌中高效表达，经复性和纯化后，获得了具有高纯度和活性的hIL-10     

猪胆囊收缩素-33基因同向四串联体的构建与表达

根据GenBank上公布的猪胆囊收缩素（choleystokinin, CCK）-33基因的cDNA序列设计特异引物，以猪十二指肠cDNA为模板，PCR扩增得到CCK33基因，并克隆入pMD18-T载体，利用引物中设计的一对同尾酶构建CCK33四串联体，并在大肠杆菌中成功表达.表达纯化蛋白制备抗原，得到多克隆抗体.Western blot显示重组蛋白具有良好的免疫原性.