大鼠细小病毒KRV株培养方法的建立

目的 建立用大鼠胶质瘤细胞系( Rat glial cell line C6)替代大鼠原代胚细胞(Primary rat embryo cells,RE)来 培养大鼠细小病毒（Kilham Rat Virus,KRV）的方法。方法 将500 TCID50 KRV培养物接种到75T-C6细胞培养瓶 中（ 细胞接种量为2×105/mL）, 培养过夜, 待细胞病变CPE达++～+++时, 分别用免疫荧光(FITC)鉴定所培 养病毒的特异抗原,用血球凝集试验(HA)测定培养物上清的效价,用DNA测序鉴定所培养的病毒,最后用96孔 板培养法测定KRV的TCID50。结果 KRV在接种到C6细胞的第4～5天, 细胞发生明显的病变,CPE可达++++, FITC鉴定呈KRV抗原阳性, 病毒的培养上清中HA效价为1:5 120,测序结果表明, 该病毒序列与NCBI中KRV序 列同源性达98％ , 确定为KRV。收获的KRV的TCID50为104.6/0.1 mL。结论 通过对C6细胞系培养KRV方法 的标准化和对所培养病毒的一系列鉴定表明,用大鼠胶质瘤细胞系可以替代大鼠原代胚细胞系进行大鼠细小病毒 的培养。     

雏番鸭细小病毒人工感染雏鸡体内带毒时间的测定

应用雏番鸭细小病毒(Muscovy Ducklling Parvovirus.MPV)南海里水株番鸭胚传代病毒人工感染7日龄石歧杂雏鸡,每只用本病毒原液经颈部皮下、口服及滴鼻共接种1.5ml/只.接种病毒的雏鸡隔离饲养,注意观察有无异常症状,并分别于接种后24小时、72小时、7天、14天、28天各随机迫杀5只雏鸡,每次迫杀鸡只收集心、肝、脾、肾、脑无菌处理成1:10悬浊液,反复冻融5～6次,3000rpm15分钟,离心取上清液速冻保存.所获无菌上清液分别在11天龄健康番鸭胚连传3代.每个样品重复1次.收集传代胚液作病毒鉴定.结果应用MPV人工感染雏鸡,不见任阿异常症状.于接种后24小时、72小时、7天追杀者可重复分离到本病毒,人工感染14天后,不能复分离病毒.复分离病毒经中和试验,琼脂扩散试验和电镜观察可确认为MPV.试验结果表明,雏鸡属于本病的非易感动物,但人工大剂量接种MPV,体内带毒时间最少可持续7天.     

棉钤虫核多角体病毒在离体细胞内的复制

用棉铃虫病毒(VHA—273)感染棉铃虫细胞的原代培养,成功地复制了病毒核多角体. 供感染用的细胞已长成单层,并经过四次换液,病毒接种物是采用病虫的血淋巴. 病毒复制的整个过程进行较快。4—5天即巳完成。多角体的数量也较多. 培养的细胞在接种病毒的第二天,即开始发生病变,此时细胞肿胀,胞核膨大。第三天,核内开始出现大量的多角体,占满了整个胞核,第四天起,部分细胞开始解体,通过镜检,可在培养液内看到许多游离的多角体。     

无血清微载体培养MDCK细胞和甲型流感病毒H1N1的条件优化

 血清微载体培养MDCK细胞,并接种流感病毒H1N1,优化培养条件,为细胞流感疫苗的工艺研发奠定基础.采用不同的细胞接种量在50mL无血清微载体搅拌瓶中培养MDCK细胞,并接种甲型流感病毒H1N1,检测不同pH值和TPCK-胰酶含量的病毒培养液,不同病毒接种量,补加TPCK-胰酶,以及不同收毒时间对血凝效价的影响.以1.0×10⁵mL^-1的MDCK细胞数量接种到无血清微载体上,病毒培养液pH值为7.2~7.4范围内,TPCK-胰酶质量浓度为1.0μg/mL,接种后不补加胰酶,病毒接种量MOI=1.0,并在72h收获,最高血凝效价达到512.由此获得了在无血清为载体上培养MDCK细胞和甲型流感病毒H1N1的适宜条件.     

猫疱疹病毒Ⅰ型( FHV-1) 抗体 ELISA 检测方法的建立与初步应用

摘要: 目的 建立猫疱疹病毒Ⅰ型( FHV-1) 抗体 ELISA 检测方法,应用于临床样品中 FHV-1 抗体的检测。方法 培养猫肾传代细胞( CRFK) ,接种 FHV-1 病毒,制备 CRFK 正常抗原和 FHV-1 特异抗原,滴定山羊抗猫 IgG-HRP 和 抗原最佳工作浓度,并进行特异性、敏感性、稳定性及精密性实验。结果 正常抗原、特异抗原和酶结合物最佳工 作浓度分别为 0. 05 μg /mL、10 μg /mL 和 1∶ 5 000; 正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为 8. 7% 和 5. 8% ,批间平均变异系数分别为 11. 9% 和 6. 6% ; 检测灵敏度为 1∶ 6 400; 与猫细小病毒( FPV) 、猫杯状病毒( FCV) 均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于 25% 。结论 建立的 ELISA 方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强,可用于猫 FHV-1 抗体的检测。     

MDVRispens株B抗的基因的酶切及序列分析

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）血清Ⅰ型Ｒｉｓｐｅｎｓ株接种原代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）,待出现８０％以上细胞病变后收获,提取细胞和病毒的总ＤＮＡ,以此为模板,根据Ｂ抗原基因核苷酸序列设计一对引物,通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出一条约２．８５ｋ的特异性条带,双酶消化后克隆至质粒ｐＵＣ１９,酶切分析表明该病毒的Ｂ抗原基因上ＨｉｎｄⅡ、ＥｃｏＲⅤ、ＢａｍＨⅠ、ＥｃｏＲⅠ的酶切位点分布与ＲＢ１Ｂ株、ＧＡ株的     

不同接种密度对Caco-2细胞吸收模型分化及去极化评价指标的影响

为确定不同接种密度对Caco-2细胞吸收模型分化及去极化评价指标的影响,以及细胞模型适用于吸收和转运试验的时间,采用Caco-2细胞高密度(1×105cells·cm-2)、中密度(5×104cells·cm-2)和低密度(3×104cells·cm-2)等3个接种密度,分别接种于带聚碳酸酯微孔滤膜插槽的Transwell 6孔板上,培养29 d,通过测定跨膜电阻值(TEER)、碱性磷酸酶活性(ALP)和酚红透过率,评价细胞单层的完整性、极化和透过性。结果表明,高、中、低密度接种分别于第12天、第15天和第18天TEER值超过600Ω·cm2,第27天、第29天和第29天TEER值开始下降。高、中、低密度接种分别于第15天、第18天和第21天上下侧碱性磷酸酶活性的比值都能达到10倍以上,第29天开始降低。高、中、低密度接种分别于第9天、第12天和第15天酚红透过率小于0.5%。综合以上3项指标,高密度接种细胞在第15天、中密度接种细胞在第18天、低密度接种细胞在第21天开始,可以用于吸收和转运试验,27 d以后细胞活力就开始下降,不适合做细胞模型。     

PRV闽A株gE基因抗原编码区片段在昆虫细胞中的表达研究

伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白E是一种在伪狂犬病的根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因抗原编码区片段克隆到杆状病毒Bac-to-Bac系统表达载体pFastBacHTa中,获得的重组表达载体pFastBacHTa-FS转化大肠杆菌DH10BAc感受态细胞后,得到的重组Bacmid DNA在脂质体介导下转染粉蚊夜蛾Hi5细胞,通过细胞内同源重组,获得了含目的片段的重组病毒.此重组病毒感染Hi5细胞后72 h,细胞总蛋白的SDS-PAGE与Western-Blot结果表明,gE基因抗原编码区片段在Hi5细胞中得到了正确表达,表达产物约35000,占细胞总蛋白的9.31%.溶解性分析显示该片段在Hi5细胞中为不可溶性表达.     

猕猴肉瘤病毒SV40 T-ag-C 基因克隆及序列分析

摘要: 目的对来源于一株自然感染猕猴肉瘤病毒SV40 的猴肾细胞培养物进行大T 抗原C-羧基端( T-ag-C) 基因 克隆及核苷酸序列分析。方法采用PCR 法分别从一株自然感染SV40 病毒的猴肾细胞培养物和SV40776 标准 株接种的vero 细胞培养物提取的总DNA 中扩增出441bp 的SV40 大T 抗原C-羧基端( T-ag-C) 基因片段,分别将其 克隆到PMD18-T 载体中,转化至JM109 感受态大肠杆菌细胞后,挑取阳性克隆进行测序鉴定,并对获得的目的基 因核苷酸序列进行序列分析及同源性分析。结果来源于猴肾细胞培养物的SV40 大T 抗原片段与本实验室来源 于云南野生猴群的猕猴外周血所得到的SV40 大T 抗原片段同源性为97. 31% ,与GenBank 中登录号为NC _ 001669. 1 序列进行比对,同源性为96. 33% ; 与SV40-776 标准株接种的vero 细胞培养物所扩增的大T 抗原片段同 源性为97. 55% 。结论对大T 抗原基因克隆和序列分析是了解和掌握SV40 病毒分子流行病学及其变异趋势的 重要手段。     

免疫电镜及感染菜豆黄色花叶病毒的寄主叶片细胞超微结构的研究

本文详述了用免疫电镜法鉴定苜蓿病毒分离物M—4及不同时期感染该病毒的不同寄主叶片细胞超微结构的研究。免疫电镜测定结果证明分离物M—4是菜豆黄色花叶病毒(BYMV)。该病毒可侵染苋色藜、三叶草,菜叶、蚕豆等寄主。这些寄主的超微结构特征。1、细胞内有风轮状、带状和环状三种形式的内含体。2、不同寄主细胞中三种内含体的数量不同。3、病毒粒子较少,分布在液泡膜附近。4、接种不同时期寄主叶片细胞中叶绿体及内含体数量有所变化,接种第30天时内含体数量最多,并能看到一些细胞质束丝。     

天花粉蛋白抗人免疫缺陷病毒1型研究

目的检测用基因工程方法制备的天花粉蛋白抗人免疫缺陷病毒1型的活性。方法将人免疫缺陷病毒1型在细胞系中培养,加入天花粉蛋白后,观察细胞病变情况,检测P24抗原及逆转录酶的活性。结果加入天花粉蛋白的细胞始终未见细胞病变,P24抗原及逆转录酶检测均为阴性;阴性对照组细胞在第7 d以后均出现人免疫缺陷病毒1型感染典型细胞病变,P24抗原及逆转录酶检测均为阳性;阳性对照组始终未见HIV-1感染典型细胞病变,逆转录酶的活性检测和P24抗原检测结果均为阴性。结论天花粉蛋白在培养细胞系中可以有效地抑制人免疫缺陷病毒1型。     

微囊藻毒素MC-LR对Raji细胞中Epstein-Barr病毒早期抗原的诱导

：研究微囊藻毒素-LR对EB病毒早期抗原的诱导作用。采用免疫酶法激活Raji细胞中EB病毒早期抗原的表达。微囊藻毒素-LR可以诱导Raji细胞中EB病毒早期抗原的表达，当与丁酸、巴豆油、TPA等促癌物协同作用时，其表达率明显增高。     

传统抗原、重组抗原检测啮齿类动物病毒的ELISA法敏感性和特异性

酶联免疫吸附试验 (ELISA)是一种常用的检测啮齿动物血清病毒抗体的方法。用于检测血清抗体的抗原可是用常规方法制备的全病毒或是在原核或真核系统中表达的重组抗原蛋白。利用杆状病毒表达系统已获得细小病毒、沙粒样病毒和冠状病毒的带有His标记的重组病毒抗原。重组抗原在昆虫细胞中表达裂解后 ,可用色谱法提纯。提纯的抗原用来包被 96孔ELISA板。用细小病毒非结构蛋白 (NS 1) ELISA法检测啮齿动物血清 ,在检测的 345 7份样本中有 88份 (2 5 % )NS 1抗体阳性 ,9份 (0 3% )为非特异性反应。虽然NS 1ELISA检测NS 1抗体具有…     

利用牙鲆鳃细胞系分离和培养淋巴囊肿病毒

本利用牙鲆鳃细胞系进行了养殖牙鲆淋巴囊肿病毒的分离及培养，并通过电镜对培养细胞中淋巴囊肿病毒的形态及感染循环进行了初步研究。将病鱼的淋巴囊肿组织无菌滤液接种牙鲆细胞系，细胞出现了明显的细胞病变（Cytopathic effect,CPE)。电镜观察在培养细胞的胞质中有病毒的包涵体，胞质中散在6角形、5角形或圆形的病毒粒子，大小为100－140nm之间。在感染细胞的线粒体中也存在大量的病毒颗粒。     

重组人凝血因子Ⅶ在HEK293细胞中的瞬时表达

[目的]在HEK293细胞中表达人凝血因子Ⅶ(human coagulation factor,hFⅦ)蛋白。[方法]通过PCR分别扩增与hFⅦ羧基化有关的酶(γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)和维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1))基因序列,与hFⅦ基因片段构建真核表达载体p CAEVKORC1-GGCX-hFⅦ,利用脂质体将表达载体转入HEK293细胞,采用Western blotting和ELISA方法检测细胞上清中hFⅦ的表达水平,凝血因子Ⅶ检测试剂盒测定hFⅦ的促凝血活性。[结果]Western blotting检测细胞上清中含有hFⅦ蛋白,经ELISA检测表达量为12 mg/L,凝血因子Ⅶ检测试剂盒测定hFⅦ的促凝血相对比活性为612%。[结论]该表达载体成功在HEK293细胞中瞬时表达hFⅦ蛋白,为进一步深入研究hFⅦ的生物学特性奠定了基础。     

表达抗PD-1抗体的溶瘤病毒在结肠癌腹腔移植瘤模型中的抗肿瘤作用

为了研究表达小鼠抗PD-1抗体(VT1093M)的溶瘤病毒对结肠癌腹腔移植瘤模型的抗肿瘤作用,利用BALB/c小鼠成瘤的小鼠结肠癌CT26-luc细胞株建立了结肠癌腹腔移植瘤模型。接种后第8天进行分组,设置生理盐水(normal saline, NS)组、病毒VT09X组和VT1093M组,每组5只,注射剂量为2.5×10⁷ pfu/250μL,NS注射250μL,每隔一天注射一次,共注射5次。末次注射后6 d,脱颈处死小鼠,提取外周血中CD45⁺细胞和腹水细胞,进行体外杀伤实验。治疗组初次出现荧光消失后第13天,进行再挑战实验。结果表明,造模实验确定最佳接种条件为200μL的2.5×10⁶个/mL细胞悬液;药效实验中,VT09X组和VT1093M组较NS组具有明显的肿瘤抑制效果,VT1093M组治疗期间出现肿瘤消失情况,较VT09X组抑瘤效果明显,但差异无统计学意义;再挑战实验中,VT1093M组均未出现肿瘤再次生长;在体外杀伤实验中,注射病毒组的外周血CD45⁺细胞在靶效比为1∶40时对CT26...     

喀左县蒙古族中学606名学生接种乙肝疫苗免疫效果

为了解国产重组（CHO细跑）乙型肝炎疫苗在14～20岁年龄段人群中免疫反映效果。本研究采用ELISA．RIA等法检测接种对象血清中乙肝病毒抗原抗体。对乙肝病毒感染阴性者,按0、1、6月3针方案,每次接种国产重组（CHO细胞）乙性肝炎疫苗5μg／支。     

多瘤病毒的培养特性及血清抗体的检查

多瘤病毒最适宜的培养条件为接种病毒吸附1.5h,培养第4天换液1次,用无牛血清维持液培养12天,其血凝素达高峰。当培养物出现血凝素时,即有细胞内抗原的存在。应用血凝抑制试验(HI)和酶免疫法(EIA)两种方法进行对比性试验,检查实验感染多瘤病毒的10只SPF小鼠和192只普通小鼠血清多瘤病毒抗体的出现,实验结果表明HI较EIA敏感。多瘤病毒存在于我国普通饲养的实验小鼠群中。     

猪病毒性脑心肌炎的诊断与防制

对一猪场的病猪进行了临床检查、免疫学检测、病理解剖及组织学观察,结果表明：经ELISA脑心肌炎病毒抗原检测,抗原阳性;临床检查显示急性出血性热性败血症、不典型神经症状;组织学检查显示急性心肌炎、非化脓性脑炎、急性出血性淋巴结炎;结论为猪病毒性脑心肌炎。     

禽流感AGP 反应建立及其条件优化

将禽流感病毒接种于12 d鸭胚,接种后24,36,48 h分别采取其绒毛尿囊液、绒毛尿囊膜、胚体,其中绒毛尿囊膜及胚体制成18种AGP抗原,并与标准AGP阳性血清进行AGP反应,结果表明:取48 h死亡鸭胚的绒毛尿囊膜经过研磨、反复冻融及灭活制备的AGP抗原与标准AGP阳性血清反应效果最佳.