植物乳杆菌FZU122产细菌素的分离鉴定及其抑菌活性的研究

摘要：化学合成类食品防腐剂存在食品安全风险,乳酸菌细菌素是一类具有开发与应用前景的生物源食品抗菌剂。本研究以中国传统酸菜为原料,通过抑菌试验、生理生化鉴定与16 S rDNA测序技术筛选出一株产抑菌物质的植物乳杆菌FZU122。采用醇沉、葡聚糖凝胶色谱柱与HPLC分离、纯化并结合抑菌试验由该菌株发酵液中获得一种高纯度抗菌物质。基于纳升液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用仪分析鉴定,该抗菌物质是一种由10个氨基酸组成的多肽ARLGLPVHVV,分子量1059.6553,带2个正电荷,将其命名为Plantaricin-fzu 122。抑菌实验结果显示Plantaricin-fzu 122对大肠杆菌、鼠伤沙门氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄等食源性致病菌具有不同程度的抑菌活性。综上所述,Plantaricin-fzu 122是一类可用于控制食源性致病菌污染且具有巨大开发潜力的生物防腐剂。     

来源于酸马奶的植物乳杆菌Bx6-2抑制甜瓜疫霉菌的研究

采用生长速率法测定植物乳杆菌Bx6-2的发酵液对甜瓜疫霉菌菌丝生长的影响,并对抑菌活性物质的理化性质进行了研究.结果表明,该菌的发酵液对甜瓜疫霉菌菌丝的生长有抑制作用.发酵液中的活性物质有较好的热稳定性,在pH 6.0时抑菌效果较好,对酸性蛋白酶敏感,对中性蛋白酶不敏感,常温下10 d的稳定性较好.通过调节pH、酶处理和加热处理实验,说明其抑菌活性物质不是乳酸,蛋白质类物质起了一定的抑菌作用,但其抑菌现象可能是与其他物质共同作用的结果.     

酸菜中具有抑菌活性乳酸菌的分离鉴定及其产细菌素特性

目前已有研究陆续从不同的乳酸菌中分离到细菌素,但是这些细菌素存在着抑菌谱窄的问题,寻找广谱抗菌性能的新一代细菌素具有重要的理论价值和应用前景。以市售保质期较长的8种不同品牌的酸菜为材料,将青霉菌作为指示菌,通过抑菌实验筛选出一株能产生抑菌物质的菌株L3,经过生理生化鉴定、16S rDNA测序分析确定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),故命名为植物乳杆菌L₃,NCBI序列号为MT781360。该菌株在MRS培养基中于37℃培养18~24h时产细菌素L3的抑菌活性最强。将该培养上清液采用乙酸乙酯萃取,葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50过滤分离纯化,再经Trinice-SDS-PAGE电泳结果显示,细菌素L3的分子质量约为4~5kDa。细菌素L3对蛋白酶敏感,但其活性不受过氧化氢酶的影响,初步结果显示细菌素L3为蛋白质类物质。细菌素L3在60~100℃ 处理20min或121℃处理15min仍具有较高的抑菌活性,pH值2~10范围内有良好的稳定性;对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及部分真菌具有抑菌活性。植物乳杆菌L₃分泌的细菌素L3除了具备现有细菌素的稳定性和对革兰氏阳性细菌的杀菌能力以外,还能对革兰氏阴性细菌和真菌起到抑菌效果,这对于易被真菌污染导致腐败的果蔬类产品及乳制品的保藏具有重要意义,希望研究可为具有广谱抗菌性能的天然防腐剂的生产提供新的菌种。     

以食品级原料进行植物乳杆菌发酵及其抗真菌活性的研究

用食品级的大豆蛋白培养基代替MRS培养基进行植物乳杆菌发酵,并对其抗真菌活性进行研究,以期获得安全性较高的食品防腐剂.实验结果表明,植物乳杆菌IMAU10014发酵大豆蛋白培养基后的上清液对娄地青霉具有较高的抑菌活性.为了进一步提高植物乳杆菌IMAU10014发酵液抗真菌活性,对不同碳源、氮源、pH和温度进行单因素研究,并通过L9(34)正交实验优化得到最佳培养基组合及培养条件:葡萄糖20,g/L、大豆蛋白5,g/L、pH 6.5、温度37,℃植物乳杆菌IMAU10014发酵48,h时抑菌效果最佳.对抑菌物质的理化性质分析结果表明:植物乳杆菌IMAU10014发酵浓缩上清液的抑菌活性对温度的变化不敏感;抑菌活性随着pH的升高而降低,经过蛋白酶K和胰蛋白酶处理后抑菌活性有所降低.     

1株产细菌素乳杆菌的鉴定及其所产抑菌物质的特性

从分离自内蒙古传统乳制品的67株乳杆菌中筛选得到1株产细菌素的乳杆菌KLDS 1.0355。通过API 50生化反应实验和16S rDNA序列同源性分析,鉴定该菌株为短乳杆菌。应用琼脂扩散法研究了KLDS 1.0355无细胞发酵上清液的部分特性,KLDS 1.0355的无细胞发酵上清液对热（121℃,30min）和pH值（pH 2.0～10.0）稳定,可被多种蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶和蛋白酶K失活,不能被过氧化氢酶失活,说明该抑菌物质为1种蛋白质。进一步证明了该抑菌物质的作用方式是杀菌,且抑菌谱广,可抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。     

具有抑菌活性植物乳杆菌细菌素生物稳定性研究

为了测定具有抑菌活性植物乳杆菌产细菌素的稳定性，利用乙酸乙酯萃取得到细菌素 粗提液，采用牛津杯法测定植物乳杆菌细菌素在温度、pH、酶及紫外线4种不同因素的处理下对大 肠杆菌的抑菌效果。结果表明：排除酸和过氧化氢的干扰后，植物乳杆菌细菌素仍具有抑菌性。 植物乳杆菌细菌素在121 ℃高温处理30 min后仍存有81%的抑菌活性；在pH 3.0～8.0内均有良好 的抑菌效果，在pH为8时仍保存69%的抑菌活性；在经由胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜 蛋白酶、胃蛋白酶及蛋白酶K的处理后，抑菌活性分别保留84%、98%、67%、91%、88%和98%；在经 过紫外照射2 h后，该细菌素依然保留83%的抑菌效果。说明植物乳杆菌细菌素抑菌性较稳定，食 品防腐剂可作为开发和利用。     

洋葱汁对五种常见食源性病原细菌抑菌效果研究

探讨两种不同颜色(紫皮洋葱和白皮洋葱)的生洋葱汁对五种常见食源性病原细菌(金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌)的抑菌效果.通过制备两种不同颜色的生洋葱汁,首先采用顶空取样并结合GC-MS分析两种不同生洋葱汁的主要挥发性成分,随后采用液体培养和平板抑菌试验研究两种不同颜色的洋葱汁对五种食源性病原菌的抑菌效果.GC-MS的结果分析表明含硫化合物是洋葱原汁中的主要挥发性成分,达34种,硫醚类化合物占12种.液体培养试验表明两种不同品种的洋葱原汁对五种常见的食源性病原菌均具有一定的抑菌效果,在细菌生长早期(4-6 h)抑菌效果较明显,随着培养时间的延长,抑菌效果逐渐减弱(10-12 h).抑菌效果强弱与洋葱原汁浓度呈正相关.平板抑菌试验表明洋葱原汁对金黄色葡萄球菌和志贺氏菌有很强的抑菌效果,总的来说紫色洋葱汁的抑菌效果较好些.我们的研究结果表明生洋葱汁对常见的食源性病原细菌有一定的抑菌效果,为食品保鲜和食品保健等方面均有一定的指导意义.     

一株具有广谱抑菌活性的兵马俑芽孢杆菌HS-15的筛选及其抑菌活性研究

采用高浓度土壤菌悬液涂平板法筛选出45株具有抑菌活性的菌株;以其中一株具有较强抑菌活性的菌株为研究对象,通过细胞形态特征、生理生化实验及16S rDNA序列分析等方法,将其鉴定为兵马俑芽孢杆菌,并命名为Bacillus bingmayongensis HS-15;分别用点植法和平板对峙法检测HS-15对细菌和真菌的抑菌活性,结果发现,该菌株对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都有较强的抑制作用,是一株广谱微生物拮抗菌;发酵条件优化结果表明,28 ℃发酵20 h时,发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强;经透析袋处理,抑菌活性没有变化,而胰蛋白酶和蛋白酶K处理后,抑菌活性丧失,初步推测抑菌物质为蛋白质类.本研究丰富了产抑菌活性物质微生物菌种资源库,为天然防腐剂的开发提供理论基础.     

XM16菌株及其抗菌物质对数种植物病原真菌的作用范围

以苹果腐烂病菌等14种植物病原菌为供试菌,研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn)XM16菌株及其代谢物的抑菌活性.结果表明,该菌对供试植物病原菌均表现出强烈的拮抗作用,其代谢物对供试的苹果炭疽病菌等11种病原菌具有较强的抑制作用.分泌物滤液和粗蛋白的抑菌试验进一步证实了XM16菌株抗生物质的存在,这表明XM16在培养过程中的确产生了某种对病原真菌具有强抑菌活性的抗生物质.     

东紫苏根中抑菌活性成分的研究

采用生物活性跟踪法从东紫苏根中分离出3个具有广谱抑菌活性的物质,通过波谱分析并与文献值比较,分别鉴定为卢氏冬凌草素5(Ⅰ)、槲皮素(Ⅱ)和木犀草素(Ⅲ),其中化合物Ⅰ为首次从该属植物中分离得到.抑菌试验表明:3个化合物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等有不同程度的抑菌和杀菌作用.     

干酪乳杆菌IMAU10041抗甜瓜枯萎病菌的作用及理化性质

从60株乳酸菌中筛选出22株具有抗甜瓜枯萎病菌活性的乳酸菌菌株,其中9株具有较强抗甜瓜枯萎病菌活性.对这9株乳酸菌的抗植物致病真菌谱进行研究发现,9株菌对番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜疫霉菌(Phytophthora drechsleri Tucker)、苹果炭疽病菌(Glomerella cingulate)、灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)的生长均有抑制作用.其中干酪乳杆菌IMAU10041对甜瓜枯萎病菌具有较强的抑制作用,并且对甜瓜疫霉和番茄早疫病菌有较高的抑菌活性.分别经过调节pH、加热、蛋白酶处理干酪乳杆菌IMAU10041的发酵滤液后,发现干酪乳杆菌IMAU10041发酵液具有一定的热稳定性;在pH 4.0时具有最大抑菌活性,在碱性条件下抑菌活性迅速失活;发酵液经胰蛋白酶、中性蛋白、蛋白酶K处理后失去部分抑菌活性,这表明干酪乳杆菌IMAU10041发酵液中可能含有一定的蛋白类抑菌物质.     

贝莱斯芽孢杆菌3A3-15生防和促生机制

为揭示贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)3A3-15生防和促生作用相关机理,采用9对特异性引物对其抑菌基因和促生长基因进行PCR检测,并分别通过Sackowski法、Schwyn和Neiland法检测其分泌吲哚乙酸(IAA)和嗜铁素能力,通过高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS)分析其发酵液抑菌成分,采用平板对峙实验和孢子萌发抑制实验分析该菌株的抑菌机理.结果表明,贝莱斯芽孢杆菌3A3-15中的抑菌基因包括yndJ、srfAB、ituC、bamC和fenD,促生长基因包括ysnE和dhbC.该菌株分泌嗜铁素能力较强,A_s/A_r值达到0.238,鉴定其抑菌物质为C14～C15 surfactinA,且贝莱斯芽孢杆菌3A3-15的次生代谢物能导致病原菌(尖孢镰刀菌)菌丝扭曲、膨大、畸形,对其孢子萌发抑制作用较强,抑制率达93.2%.以上结果说明贝莱斯芽孢杆菌3A3-15具有较好的生防和促生潜力,是防治尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病的潜在菌株.     

枯草芽孢杆菌FB123所产抗菌物P3c的分离纯化及其表面活性功能分析

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FB123的发酵产物经酸沉淀、凝胶层析、反相层析、薄层层析获得一单一条带P3c抗菌组分,原位酸水解茚三酮显色反应显示该组分为环脂肽物质.对P3c组分抑菌及排油圈实验表明,该组分是一种具有广谱抑菌活性的生物表面活性剂.     

内生金色链霉菌No.37产抑菌活性物质特性研究

对内生金色链霉菌No.37所产生的抗菌物质的性质进行了研究,结果显示此物质可耐受高温,具有较宽的pH活性范围,同时对光照稳定,耐贮存;在90℃及以下温度处理,抑菌活性基本不变;当温度达到100℃时,处理60min抑菌活性开始降低,处理120min后,活性为对照的76.5%.利用pH纸色谱、捷克八溶剂系统纸色谱等方法初步确认该抗菌物质为一种碱性水溶性抗生素.     

产类细菌素的乳酸菌的筛选及其抑菌特性研究

从青藏高原传统牦牛酸奶中筛选出一株乳酸菌,排除酸和过氧化氢的干扰后,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)和大肠杆菌(Escherichia coli)有明显的抑制作用.经形态学、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析等手段鉴定该菌株为乳明串珠菌(Leuconostoc lactis).用蛋白酶处理该菌株的发酵上清液后, 抑菌活性丧失; 发酵上清液具有较好的热稳定性(经121 ℃处理20 min仍有较强抑菌活性)和pH稳定性 (在pH 3.0～10.0之间保持活性), 因此初步认为该菌株产生的抑菌物质属于类细菌素.研究发现该菌株在培养8 h后出现抑菌活性,在20 h时抑菌活性达到最大并一直到发酵结束.     

泡菜中植物乳杆菌的分离及鉴定

使用MRS培养基从泡菜中分离出的菌株经接触酶实验,葡萄糖产酸产气实验,淀粉水解实验和革兰氏染色镜检鉴定该菌株是植物乳酸杆菌,该实验为研究乳酸菌催化亚油酸（Linoleic acid,LA）转化为共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）提供基础.     

苦瓜籽中抗真菌蛋白MAP13的分离纯化与表征

将苦瓜籽粗提液分别经阴离子色谱柱、阳离子色谱柱交换后,得到一个具有抗真菌活性的蛋白MAP13.该蛋白经鉴定达到电泳纯,相对分子量为12.7 kDa.经还原剂处理后,电泳结果表明该蛋白由分子量分别为7和6 kDa的两个亚基组成,亚基之间通过二硫键连接.体外抑菌实验表明该蛋白对苹果轮纹病菌、瓜果腐霉病菌和棉花枯萎病菌具有较强的抑制作用.     

凝结芽孢杆菌TQ33产抗疫霉物质特性研究

凝结芽孢杆菌TQ33是从脱脂奶粉中分离出来的,发现其发酵液中活性代谢产物对甜瓜疫霉菌(Phytophthora drechsleri Tucker)、灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜枯萎病菌(Fusarium ox-ysporum)、苹果炭疽病菌(Glomerella cingulate)植物致病真菌有很好的抑制作用,其中对甜瓜疫霉菌具有较强的抑制作用,同时对抗甜瓜疫霉物质特性进行了研究,将具有抑菌活性的发酵液分别经过调节pH、加热、蛋白酶处理后发现,凝结芽孢杆菌TQ33发酵液具有一定的热稳定性;在pH,5～6时具有最大抑菌活性,发酵液经胰蛋白酶、中性蛋白、蛋白酶K处理后失去部分抑菌活性,初步分离纯化实验表明其中一种抗菌物质可能是苯乳酸,这表明凝结芽孢杆菌TQ33发酵液中可能含有苯乳酸,以及其他蛋白类抑菌物质.     

黑豆中抗真菌蛋白的纯化及活性鉴定

利用硫酸铵分级沉降、亲和色谱Affi-gel和离子交换色谱SP-Toyopearl从黑豆种子中分离出一种抗菌蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定达到电泳纯.利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准蛋白迁移率与分子量对数的关系,计算出该抗菌蛋白的分子量为93.3 kDa,还原和非还原状态下均显示单一区带,说明该抗真菌蛋白为单倍体蛋白.抑菌试验结果表明,此纯化的蛋白对植物致病菌瓜果腐霉病菌、棉花枯萎病菌、苹果轮纹病菌、葡萄灰霉病菌和菜豆根腐病菌等5种真菌的生长具有不同的抑制作用.     

植物乳杆菌素plantaricin Q7在牛乳贮藏保鲜中的应用

植物乳杆菌素plantaricin Q7是由植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Q7产生的,其具有广谱抑菌活性的细菌素,有安全、高效、稳定性好等优点.将效价为533 AU·mL~(-1)的植物乳杆菌素Q7添加到牛乳中,探究其在牛乳贮藏过程中的保鲜效果.结果表明:植物乳杆菌素Q7维持了牛乳良好感官,牛乳贮藏第13天时仍没有异味出现,保持乳白色、略带黄色的状态,无分层和沉淀.荧光假单胞菌是牛乳中的优势嗜冷腐败菌.未添加植物乳杆菌素Q7的牛乳中,荧光假单胞菌落数在第7天超出国标规定;添加植物乳杆菌素Q7将延长荧光假单胞菌落数超出国标规定的时间4 d.植物乳杆菌素Q7有效减缓了牛乳酸度的增加速度,降低了牛乳pH值的下降速度.本研究为植物乳杆菌素Q7的开发与应用提供了依据.