蛹虫草高产菌丝体和虫草菌素的深层培养工艺优化(英文)

蛹虫草Cordyceps militaris是当前用于功能食品和药物开发上较受国内外关注的真菌之一。本研究通过1次一因素法和正交实验设计优化了蛹虫草产虫草菌素和菌丝体的深层培养工艺。最适合菌丝生长的pH值和温度为6.0和20℃,而最适合虫草素积累的pH值和温度为5.0和26℃。蔗糖、蛋白胨、MgSO4、K2HPO4和NAA分别是最适合虫草素积累的碳源、氮源、无机盐和生长因子;培养基的成分对蛹虫草生物量的影响次序为:蔗糖>蛋白胨>MgSO4·7H2O>K2HPO4>NAA;培养基的成分对蛹虫草产虫草素的影响次序为:蛋白胨>K2HPO4>NAA>MgSO4·7H2O>蔗糖。最适合蛹虫草菌丝生长的培养基配比为4%蔗糖,2.5%蛋白胨,0.05%MgSO4·7H2O,0.15%K2HPO4,2.0mg/l NAA;最适合蛹虫草深层发酵产虫草素的培养基配比为4%蔗糖,1.5%蛋白胨,0.05%MgSO4·7H2O,0.05%K2HPO4,4.0mg/l NAA的培养基;在最佳蛹虫草深层发酵产虫草素的工艺条件下,CM8菌株胞外虫草菌素产量达到961.21 mg/l,胞内虫草菌素的含量达到12.87mg/g;菌丝体的产量为22.97 g/l,本研究得出的结论对深层培养提高蛹虫草虫草菌素和菌丝体的产量有借鉴意义。     

给予CCP技术的北虫草液体菌种培养工艺的优化试验

对北虫草液体菌种栽培工艺进行研究,通过实验确定了母种的选择、培养基的制备、培养基的灭菌、接种空间的消毒、摇床培养、发菌管理等阶段的北虫草培养的关键步骤的参数和操作方法.     

蛹虫草子实体的人工培养研究

通过对蛹虫草子实体的人工培养研究发现：固体营养物以小米和高粱米的混合物是最佳的。人工培养基的最佳碳、氮源为可溶性淀粉和蛋白胨，最佳pH范围是5～6；VB1、2，4-D和无机元素K^ 、Mg^2 、Ca^2 对子实体的生长有促进作用。最佳培养条件是湿度80％。光照6001x(24L：0D)，15℃培养10d后转到25℃下培养．蚕蛹培养子实体的条件是10℃下培养到蚕蛹僵硬后转到25℃下培养，湿度80％．     

蛹虫草液体发酵条件的研究

通过单因子筛选和正交试验 ,对蛹虫草发酵条件进行研究 .试验结果表明 ,蛹虫草发酵的适宜培养基组成为 :蔗糖 5 .0 % ,玉米浆 3.0 % ,酵母膏 0 .5 % ,MgSO4 ·7H2 O 0 .0 5 % ,KH2 PO40 .0 5 % ;适宜的培养条件为 :发酵初始pH 7.0 ,发酵温度 2 5℃ ,发酵周期 6d .采用优化的培养基及适宜的培养条件进行摇瓶发酵 ,干菌体产量和生长速率分别可达 4 1.1g/L和 0 .2 8g/L·h .     

蛹虫草液体的深层发酵

以菌丝体质量浓度(干重)和发酵液中甘露醇浓度为指标,研究温度、初始pH值、培养时间等因素对蛹虫草液体培养的影响,得到蛹虫草摇瓶液体培养的最佳温度为25.0℃,初始pH值为6.10,培养时间为5 d;蛹虫草液体发酵最适培养基的组成为:20 g/L蔗糖+5 g/L蛋白胨+1 g/L MgSO4.7H2O。在此基础上进行小型分批式发酵罐实验,研究有利于蛹虫草生长及活性物质生成的pH控制策略。研究结果表明,pH分段控制的液体深层发酵对蛹虫草生长最为有利,菌丝体质量浓度为17.31 g/L,甘露醇质量浓度达43.47 g/L。     

蚕蛹虫草菌丝生物学特性的研究

对蛹虫草菌丝体进行液体摇瓶培养，以菌丝体干重为指标，从碳源、氮源、pH、温度等方面探讨了蛹虫草菌丝的生物学特性．结果表明，蛹虫草菌丝的生长可以利用多种碳源和氮源，在以红糖为碳源、奶粉为氮源的液体培养基中生长最佳，且碳源／氮源合适的比例为2．0—2．5／1．0，适宜pH为5．0—6．5，最适pH为6．0，适宜生长温度范围为15—30℃，最适温度为25℃．     

兰坪虫草子实体人工诱导条件研究

旨在探明兰坪虫草子实体人工诱导培养的条件,为其产业化生产奠定基础。通过正交设计试验探明兰坪虫草子实体诱导培养的最佳培养基配方,并探讨了不同培养温度和不同光照条件对诱导子实体形成的影响。结果表明,子实体诱导最佳的培养基配方为OLM-2：20%鲜蚕蛹、3%麦芽糖、0.6%黄豆粉、0.05%石膏、0.1%MgSO4、0.05%KH2PO4、0.002%Vb1、0.004%烟酸、0.004%Vb6;子实体诱导的最适条件为,以昼温22℃、夜温16℃的温差刺激,及300 Lx弱光照每天光照7hr;培养20天后较高温度和较长光照时间（20℃,300 Lx每天光照12hr）有利于子实体的生长发育。在最佳诱导培养条件下获得的人工子实体与野生子实体形态结构接近,但较长、较粗。     

不同生态因子对蛹虫草菌丝生长影响的研究

本文主要针对蛹虫草菌丝生长对营养元素需求和对生态因子的要求进行试验研究。结果表明：蛹虫草菌丝生长的适宜碳源是葡萄糖，适宜氮源是蛋白胨，适宜C：N为40：1．适宜无机盐是KH2PO4，最适宜温度是20℃，最适宜含水量是70％，最适宜pH值是6．5。     

富硒虫草菌丝体的发酵培养及其生物学功能研究

采用菌种Cordyceps Sinensis进行液体发酵,在发酵培养基中添加微量Na2SeO3,虫草菌丝体收得率达2.52%,其中硒含量达7.90 mg/kg;经动物试验结果证明发酵法生产的富硒虫草菌丝体安全无毒,并具有延缓衰老之功能;其他生物功能比较研究结果表明,发酵生产的富硒虫草菌丝体在耐缺氧、抗疲劳等功能方面均优于天然虫草,因此完全可以替代天然野生虫草应用.     

北虫草培养残基中虫草素的提取纯化及抗肿瘤活性

以北虫草固体培养残基为实验材料,比较闪式提取、超声波提取和超高压提取培养残基中虫草素的效果,用陶瓷膜过滤提取液,获得虫草素粗提液,利用高速逆流色谱分离制备虫草素,通过LC-MS/MS对产物结构进行鉴定,并验证了虫草素对小鼠S180肉瘤的抑制作用。结果显示,超高压提取培养基中虫草素较好,高速逆流色谱分离纯化条件是以V(乙酸乙酯)∶V(正丁醇)∶V(水)=2∶3∶5的两相溶剂系统,上相为固定相,下相为流动相,流速3.0mL/min,主机转速900r/min,分离温度28℃,以此分离条件经一步洗脱,高速逆流色谱收集馏分,其中峰Ⅲ产物经HPLC检测纯度达97.6%,结构经LC-MS/MS鉴定为虫草素。从100g北虫草培养残基中可制备得虫草素181.90mg,并对其活性验证发现剂量为100mg/kg时小鼠S180肉瘤瘤重抑制率为64.48%。     

冬虫夏草体外溶出度研究

依据《药典》中的溶出度测定法进行冬虫夏草纳米粉胶囊、冬虫夏草粗粉胶囊及冬虫夏草药材的体外溶出实验.实验显示,冬虫夏草药材在10 min时溶出最多,冬虫夏草纳米粉胶囊及冬虫夏草粗粉胶囊都在40min时达到溶出最高点,而纳米粉溶出度高达100%.结果表明,装入胶囊的冬虫夏草粉比未装入胶囊的冬虫夏草药材,溶出度稳定,且冬虫夏草纳米粉溶出度最高.     

冬虫夏草人工培育初探

通过采用周期性变压固态发酵技术来探讨其在人工培育冬虫夏草工艺中的可行性。实验中通过正交对比实验确定了最佳实验条件 :固体培养基为大米或大米 +麸皮 ,固液比为1∶ 1～ 1.3,温度为 2 8℃ ,p H值 7.5～ 8,时间为 (15～ 2 0 ) d。周期变压条件为 :高压 0 .15MPa(表压 )时间 :10 min,低压 :0 .0 0 MPa(表压 )时间 :10 min,菌丝体的生长时间缩短了 (5～ 10 ) d,虫草多糖的得率明显的提高。     

Phylogenetic relationships of host insects of Cordyceps sinensis inferred from mitochondrial Cytochrome b sequences

This study used the sequence of the mitochondrial Cytochrome b(Cytb)to estimate phylogenetic relationships among host Hepialidae insects of Cordyceps sinensis.Genome DNA of host insect was extracted from the dead larva head part of 18 cordyceps populations and 2 species of Hepialus,and the Cytb fragment of host insect was amplified with PCR technique.The nucleotide sequence alignments and their homologous sequences of 24 species host Hepialidae insects of Cordyceps sinensis were obtained from GenBank and were used to construct phylogenetic trees based on neighbor-joining method.The results showed that genus Bipectilus diverged earlier than genus Hepialus and Hepialiscus.Hepialus host insects of Cordyceps sinensis have multitudinous species with different morphological characteristics and geographical distributions.The interspecific genetic differentiations are obvious in Hepialus.Thus,the genus Hepialus might be considered as polyphyletic origin.Cytb sequences have abundant variations among the host insects of Cordyceps sinensis on spe- cific and generic level.The divergence rate of Cytb sequences among the species in Hepialus ranged from 0.23% to 9.24%,except that Hepialus pratensis and Hepialus jinshaensis have the same sequence.Cytb sequence can be used for species identification of host insects of Cordyceps sinensis,but further confirmation in more host insect species is needed.To obtain the Cytb sequence of host insect by ampli- fying DNA extracted from the head part of dead larva in cordyceps turns out to be an effective and accurate approach,which will be useful for studies on phylogeny and genetic structure of host insects of cordyceps populations,especially for analyzing relationships between C. sinensis and its host insects.     

Phylogenetic relationships of host insects of Cordyceps sinensis inferred from mitochondrial Cytochrome b sequences

This study used the sequence of the mitochondrial Cytochrome b (Cytb) to estimate phylogenetic relationships among host Hepialidae insects of Cordyceps sinensis. Genome DNA of host insect was extracted from the dead larva head part of 18 cordyceps populations and 2 species of Hepialus, and the Cytb fragment of host insect was amplified with PCR technique. The nucleotide sequence alignments and their homologous sequences of 24 species host Hepialidae insects of Cordyceps sinensis were obtained from GenBank and were used to construct phylogenetic trees based on neighbor-joining method. The results showed that genus Bipectilus diverged earlier than genus Hepialus and Hepialiscus. Hepialus host insects of Cordyceps sinensis have multitudinous species with different morphological characteristics and geographical distributions. The interspecific genetic differentiations are obvious in Hepialus. Thus, the genus Hepialus might be considered as polyphyletic origin. Cytb sequences have abundant variations among the host insects of Cordyceps sinensis on specific and generic level. The divergence rate of Cytb sequences among the species in Hepialus ranged from 0.23% to 9.24%, except that Hepialus pratensis and Hepialus jinshaensis have the same sequence. Cytb sequence can be used for species identification of host insects of Cordyceps sinensis, but further confirmation in more host insect species is needed. To obtain the Cytb sequence of host insect by amplifying DNA extracted from the head part of dead larva in cordyceps turns out to be an effective and accurate approach, which will be useful for studies on phylogeny and genetic structure of host insects of cordyceps populations, especially for analyzing relationships between C. sinensis and its host insects.     

提高中华鳖低温孵化率的研究

探讨了在适于中华鳖胚胎发育的温度范围（２４～３５℃）内,各温度条件下的孵化率与孵化周期,及提高中华鳖低温（２４～２７℃）孵化率的温度措施。     

实验室条件下西藏冬虫夏草幼虫生理机制变化研究

为研究实验室条件下西藏冬虫夏草幼虫对温度、湿度、病害等条件的生理反应以及西藏冬虫夏草幼虫的食性情况,文章对西藏冬虫夏草幼虫的外部形态及其对温度和湿度的反应及食性等方面进行观察,并绘制出西藏冬虫夏草幼虫生长曲线。结果表明：①实验室中培养西藏冬虫夏草幼虫的最佳温度范围为12℃-14℃;②西藏冬虫夏草幼虫最喜啃食红萝卜,其次为土豆和莴笋;③西藏冬虫夏草幼虫对温度具有很高的敏感性,当温度达到20℃时,幼虫完全失去活动的能力,并且此时幼虫身体表面容易感染病菌。     

虫草头孢菌CS-866菌株发酵条件的研究

对虫草头孢菌CS-866菌株的菌丝体发酵条件进行了研究,其适宜的培养基消前pH为5.0~7.0,培养温度为26~28℃,接种量为3%~5%,最佳种龄为3 d,发酵周期4 d,培养基消前加0.3%毛豆油消沫,发酵过程中对通气量的要求较高.虫草头孢菌丝体所含氨基酸与天然冬虫夏草相近,红外吸收光谱也表明两者所含的各类化学成分极为相似.     

温度对中华倒刺鲃静止代谢及低氧耐受的影响

为考查温度对鱼类静止代谢率及低氧耐受能力的影响,本研究以中华倒刺鲃（Spinibarbus sinensis）幼鱼为对象,分别在10、20和30℃条件下驯化2周,随后将实验鱼置于密闭呼吸室中测定静止代谢率,并通过“双线法”推出临界氧压（Pcrit）等相关参数。实验结果显示：随着温度的上升,中华倒刺鲃幼鱼静止代谢率（MO2rest）、Pcrit点所对应代谢率（MO2pcrit）以及临界代谢范围（MMS）均显著上升（p〈0.05）;MO2rest的温度系数（Q10）在10-20 ℃和20-30 ℃间分别为2.54和1.27。而中华倒刺鲃幼鱼Pcrit却不受温度变化的显著影响,表现出一定的保守性。研究表明,中华倒刺鲃幼鱼Pcrit随温度的变化趋势并不与 MO2rest的变化趋势相吻合,这提示随温度的改变中华倒刺鲃可能还启用了其他生理、生化和（或）行为学机制。     

中华鲟囊胚细胞的长期保存及其克隆胚胎发育观察

为保存濒危鱼类中华鲟种质资源,在0、-20、-80、-196℃4种不同的温度下对其囊胚细胞进行了长期保存试验,细胞存活期分别为10d、30d和2年,在液氮中(-196℃)保存2年后仍有60.7%存活率;用冷冻复苏后的细胞进行核移植,并对克隆胚胎的发育进行了观察.共移植417枚卵,获得2尾克隆幼鲟,成功率为0.48%,表明长期冷冻保存的囊胚细胞仍具有发育全能性,通过克隆技术能获得存活个体.此项技术为濒危物种的保护开辟了新途径.     

火灾中的木耳燃烧特性

对湖南衡阳“11．3”特大火灾事故的重要可燃物木耳，进行了小尺寸和全尺寸实验．采用两种最常见的点燃方式，即外部辐射着火和内部受热着火，点燃木耳，以便多角度研究其燃烧特性．外部辐射着火的方式采用符合ISO5660标准的小型锥形量热计来实现，测量其热释放速率及质量损失速率．实验表明，在相同的外部辐射功率下，粉状木耳比原状木耳更易点燃，而且，木耳的点燃辐射功率存在一个临界值．同时，木耳的质量损失速率不是影响其热释放速率的惟一因素．内部受热着火的方式采用符合ISO9705标准的全尺寸多功能热释放速率实验台来实现，测量包括热释放速率、质量损失速率、房间内温度场、组分浓度等多个物性参数．质量损失速率、各点温度以及产物一氧化碳浓度变化曲线均与热释放速率曲线的变化趋势保持一致．