转基因和再克隆对克隆胚胎细胞凋亡的影响

细胞凋亡在着床前胚胎发育过程中发挥着重要作用,胚胎凋亡检测能为获得高质量的体细胞克隆胚胎提供有益信息,进而有助于提高克隆效率.用原位末端标记法对牛的转基因克隆和转基因再克隆囊胚进行了细胞凋亡检测,再克隆囊胚是利用转基因克隆牛的体细胞作为供体细胞进行体细胞核移植后获得的第二代克隆胚胎.结果表明转基因克隆胚胎的囊胚发育率显著低于非转基因克隆胚胎的囊胚发育率,而转基因克隆囊胚的细胞凋亡指数显著高于非转基因克隆胚胎的细胞凋亡指数.此外,转基因再克隆胚胎的囊胚发育率和胚胎细胞凋亡指数与非转基因克隆胚胎的囊胚发育率和胚胎细胞凋亡指数相比差异性不显著.结果表明早期的转基因克隆胚胎发育能力的减弱可能是由于供体细胞的基因转染和药物筛选过程导致的,而再克隆对其早期胚胎的发育能力没有负面影响.     

实验用小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞为核供体生产转基因克隆胚胎

目的比较不同类型体细胞对生产转基因克隆胚胎效率的影响。方法利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-N1转染到五指山小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞,经过G418筛选后均获得了阳性细胞株。然后分别以两种类型转基因细胞以及未转基因细胞为核供体进行体细胞核移植,比较不同类型供体细胞克隆胚胎的囊胚发育率。结果胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞克隆胚的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,8.3%vs.7.1%);转基因胎儿成纤维细胞(9.6%)和转基因骨髓间充质细胞(9.9%)克隆胚胎的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,9.6%vs.9.9%);每一种类型供体细胞转基因与否对克隆胚的囊胚发育率无影响(P>0.05)。结论通过体细胞核移植技术,小型猪骨髓间充质细胞与胎儿成纤维细胞均可有效地生产转基因囊胚。     

魔芋花粉短期储藏技术及其活力特性研究

魔芋花粉保存对于杂交育种克服花期不遇具有重要的意义.以离体收集的魔芋新鲜花粉,通过萌发检测活力,研究了室温4℃、-20℃、-80℃、液氮(-196℃)条件下保存效果.结果表明:适宜魔芋花粉发芽的培养基为5%(w/v)蔗糖、200 mg/L H_3BO_3、400 mg/L CaCl_2和0.7%(w/v)琼脂,0.5%(v/v)甘油可防止花粉管干缩,稀释2000倍的有机硅有利于花粉颗粒在培养基上均匀分布.室温下花粉存活时间为10 h,4℃保存4 d活力变化不大;-20℃保存2d内活力急剧下降;-80℃在5d内下降较快,以后趋于平缓;-196℃保存具有"冷适应"现象,前期下降,后期上升,保存1个月以上仍有较高的活力.91个单株花粉(其中花魔芋26份,白魔芋15份,杂交魔芋42份,西盟魔芋4份,东京魔芋1份,勐海魔芋3份)在4℃、-20℃、-80℃、液氮(-196℃)保存(33.8±0.4) d,花粉平均发芽率为0. 6%、2.5%、11.1%、34.1%.因此,4℃是魔芋新鲜花粉储存1～4 d较好的方法,-80℃和-196℃储存30 d效果较好,珍贵的遗传材料以液氮保存更加安全,-20℃不适宜魔芋花粉储存.本研究为魔芋定向杂交育种实践奠定了基础.     

乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠 2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的 评价用乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠 2-细胞胚胎冷冻保存的效果。方法 通过超排卵处理 后与雄鼠交配获得长爪沙鼠 2-细胞胚胎,胚胎在冷冻液 EFS20 中平衡 3 min,然后移入冷冻液 EFS40 中平衡 1 min, 之后将细胞冻存管直接浸入液氮中保存。采用二步法复苏胚胎,复苏后移入改良的胚胎培养液( mKSOM) 中体外 培养。结果 采用该方法冷冻的胚胎复苏后胚胎回收率为 86. 73% ,存活率为 82. 94% ,复苏后存活的胚胎中约 1 / 3 胚胎可以在体外发育到囊胚。结论 乙二醇玻璃化冷冻液适于冷冻保存长爪沙鼠 2-细胞胚胎。     

快速冷冻和解冻鼠胚的存活力

桑椹期鼠胚在1.0—2.5M 的二甲亚砜(DMSO)溶液中经三步程序快速冷冻到-196℃;试样在-4—-8℃诱异结晶,在-20℃的酒精浴槽保持10分钟,在—100℃液氮上垂悬10分钟,然后,立即放入液氮(—196℃)。在-20℃—-75℃之间降温速度为～17℃/分。快速解冻(360℃/分)在所有的 DMSO 浓度中培养48小时后发育到完整囊胚的比例高于慢速解冻(25℃/分)。在1.5—2.0M-DMSO 浓度中快速冷冻的胚胎获得最高的成活率(分别为36和53%)。经三步冷冻和快速解冻的胚胎用多种除去 DMSO 成分的方法进行试验。获得培养到完整囊胚的最好结果是在室温下在磷酸缓冲液(PBS) 2.0M-DMSO 0.5M 蔗糖溶液停留(2分钟),然后,在 PBS 0.5M 蔗糖溶液(2分钟)(82%)以及在30℃下分阶段稀释在 PBS 溶液中的胚胎(70%)。当胚胎快速冷冻并快速解冻后在培养液中培养到囊胚期的26个胚胎移植给2支受体得到11个仔鼠(42%)。     

小鼠胚胎一步冷冻法的探讨

超排处理81只昆明小白鼠、把出现阴道栓的42只小鼠进行冲卵,得到301枚胚胎。选用205枚晚期桑椹胚进行一步法冷冻至-196℃,经37℃水浴中解冻后,回收胚胎202枚,回收率为98.5％。将解冻后形态正常的175枚胚胎,经过处理,放置在37℃的CO_2培养箱中进行培养。同时,又用64枚新鲜胚胎(晚期桑椹胚)、一并放入培养箱中进行培养。经过24小时的培养,取出镜检,经过冷冻一解冻后培养的胚胎,发育的有54枚,新鲜胚胎发育的有35枚,48小时后再次镜检结果。发育到囊胚的解冻胚胎仅有10枚,占5.7％。新鲜胚胎发育到囊胚的为9.4％。通过本试验证明:小鼠的晚期桑椹胚,经过一步法冷冻至-196℃。再经解冻后进行培养。是能够获得进一步发育的。     

卵母细胞老化对小鼠体细胞克隆胚发育的影响

就小鼠卵母细胞的卵龄对克隆胚的体外发育能力的影响进行了检测,以确定最佳的取卵时间,以及取卵后进行核移植操作的可耐受的时间。采用PMSG和hCG超排B6D2F1雌鼠。在体内老化实验中,分别于注射hCG后13,15,17,20h取卵用于核移植操作;在体外老化实验中,所有的卵均于注射hCG后13h取出并培养,然后在13,15,17,20h进行核移植操作。每个时间点的核移植操作在1h内完成,重构的胚胎培养1h后进行激活。结果显示:在体内老化实验中,注射hCG后13h取卵,获得的克隆囊胚发育率最高,为56.0%,15h取卵仍维持了其支持胚胎体外发育的能力,但17h及更长时间后取的卵,重构后的囊胚发育率显著下降(18.1%)。注射hCG后15h取的卵孤雌发育率最高(囊胚发育率为90.1%),并在17h仍维持较高的孤雌发育能力,在20h显著下降。在体外老化试验中,于注射hCG后13h取卵,分别于13,15,17h重构,都获得了较高的囊胚发育率(分别为57.7%,52.2%,46.3%),而在注射hCG后20h重构,囊胚发育率显著下降(14.8%)。体外老化的孤雌胚在注射hCG后22h激活时囊胚发育率显著下降。结果表明:卵母细胞在体内和体外老化都影响克隆胚的体外发育,最佳取卵时间为注射hCG后13h,取卵后立即用于重构可获得最佳囊胚发育率;体内、外老化卵支持重构胚较好发育的时间间隔是不同的,体内老化卵支持重构胚发育能力从注射hCG后17h开始下降,体外老化卵则发生在20h。这些结果可以指导操作,有利于在应用核移植进行其他基础研究时降低操作引起的误差。     

细叶小羽藓孢子的超低温保存

通过对干燥时间及预处理温度等超低温保存条件的实验探索,筛选出细叶小羽藓(Haplocladium microphyllum)孢子超低温最适保存条件,利用最适保存条件对细叶小羽藓孢子进行不同时间(1 d、15 d、30 d、90 d、180 d)的超低温保存研究,并与未经任何处理直接投入液氮的孢子进行比较.结果表明:(1)细叶小羽藓孢子在硅胶干燥5 h、-20℃低温预处理和室温自来水化冻的条件下的平均萌发率最高(88.26%),干燥20 h、常温处理的孢子与干燥5 h、-20℃低温预处理的孢子平均萌发率差异不显著;(2)液氮保存1 d后的孢子平均萌发率(88.26%)高于未用液氮保存的孢子平均萌发率(77.90%),保存30 d后的孢子平均萌发率降为6.03%,而保存90 d后平均萌发率又出现上升的趋势,达到88.47%,保存180 d后平均萌发率仍维持在49.46%,相对保持率为63.49%.因此,使用液氮超低温长期保存细叶小羽藓孢子是可行的.     

内蒙古白绒山羊的体细胞克隆

内蒙古白绒山羊是具有悠久历史的绒肉兼用的品种,对荒漠和半荒漠环境有较强的适应性.山羊绒是来自绒山羊的细绒毛,具有极高的商业价值.为了扩大优秀绒山羊数量,本试验尝试利用体细胞克隆技术进行绒山羊克隆研究.从一只成年优秀公绒山羊中,取其耳缘组织,培养获得成纤维细胞.从当地屠宰场获得山羊卵巢,抽取卵母细胞并体外培养成熟.然后以绒山羊成纤维细胞为核供体,通过体细胞克隆技术生产克隆胚胎.核移植重构胚的融合率、卵裂率和囊胚发育率分别为75.8%,72.6%和11.6%.将处于1-至2-细胞期的胚胎移植入同期发情受体母山羊输卵管中,于2009年4月30日诞生了一只克隆绒山羊.该克隆羊的生长状态及产绒量与细胞核供体山羊相一致,呈现良好的发育态势,说明体细胞克隆技术可以成为良种绒山羊的扩繁途径.     

成纤维细胞和ES细胞在小鼠和兔去核卵母细胞内发育

以昆明白小鼠成纤维细胞和胚胎干（ES）细胞作为供核细胞，以昆明白小鼠和日本大耳白兔的MⅡ期去核卵母细胞作为受体，采用核移植方法，构楚了克隆胚胎．在同种克隆中，以ES细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率明显低于以成纤维细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率（24．4％相对于56．9％，P〈0．05），1．8％的ES细胞克隆胚胎发育到囊胚阶段，而成纤维细胞克隆胚胎没能发育到囊胚阶段；在异种克隆中，以ES细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率（89．6％）和囊胚发育率（18．8％）明显高于以成纤维细胞为供核细胞的克隆胚胎卵裂率（54．2％）和囊胚发育率（4．2％）．     

Nuclear transplantation in different strains of zebrafish

Single later blastula nuclei from AB strain of zebrafish (Danio rerio) were transplanted into enucleated unfertilized eggs of Long fin strain. Of 1119 cloning embryos, 14 reconstructed embryos developed into fry. DNA fingerprinting systems of the cloned fish were similar to those of the nuclear donor fish, but were distinctly different from those of the nuclear recipient fish. It confirmed that the genetic material originated from nuclear donor cell other than from nuclear recipient egg. The research suggested that the basic technique for nuclear transplantation performed with different strains of zebrafish has made a breakthrough. It should be helpful for the study of some important developmental problems such as gene function, the regulation ogene expression during animal development, the developmental potential of a nucleus and the interactions between the donor nucleus and the recipient cytoplasm, etc.     

酒精和冷冻处理对肌肉组织基因组DNA提取的影响

提取基因组DNA的质量对于后续的基因扩增、酶切以及测序等分子生物学研究具有关键的影响,对肌肉组织进行不同的酒精和冷冻处理会显著影响提取DNA的质量。经过-80℃超低温冷冻数日的黄鳝样品解冻,取肌肉组织放入75%酒精处理后提取的基因组DNA完整性差、降解厉害;经过-80℃超低温冷冻数日的黄鳝样品直接取肌肉组织提取的基因组DNA比较完整、降解程度低;活体采取的黄鳝新鲜肌肉组织样品经过75%酒精处理,在-80℃超低温冷冻数日然后提取的基因组DNA质量也较好,电泳条带明晰而锐利,弥散降解带较少。后两种处理方法对黄鳝肌肉组织中DNA酶活性降低显著,因此提取的肌肉组织基因组DNA质量较高,可以有力支持后续的酶切、PCR扩增等分子生物学实验。     

松材线虫低温冷冻保存研究

为满足大量松材线虫虫株长期保存的需要,对其低温冷冻保存技术进行了研究。试验比较了不同种类及浓度冷冻保护剂对松材线虫在低温冷冻保存时的保护效果,以及冷冻线虫繁殖力与致病力的变化。结果表明:使用15%甘油和4%DMSO作为冷冻保护剂,经-80℃保存1 d后,松材线虫存活率分别为(39.4±6.6)%和(37.5±21.8)%,且冻存10 d、1个月后均没有显著性下降。与未冷冻的线虫相比,冷冻线虫的繁殖力与致病力均未发生改变。     

抗松材线虫病赤松组培苗的生根与移栽研究

以抗病性较好但不易生根的抗松材线虫病赤松无性系为试验材料,对影响组培苗生根移栽的因素进行了研究。结果表明：将待生根的丛生芽置于17 ℃条件下处理5 d后,不定根诱导率最高达93 %;在生根培养基中添加3050 mg/L香蕉汁有利于不定根诱导;对移栽基质进行高温灭菌或0.2 %高锰酸钾消毒2次的处理均可有效提高组培苗移栽成活率;喷施营养液对组培苗的长势具有促进作用。     

高原环境心肌细胞体外生长特性研究

目的：研究高原环境心肌细胞体外生长特性,作为高原环境研究心肌细胞功能的实验基础。方法：将心肌细胞系复苏后使用体积分数为0.15的高糖DMEM培养基接种于33mm培养皿中并置于37℃5%CO2培养箱中进行培养;台盼蓝染色法检测细胞的成活率,并观察心肌细胞的形态变化,CCK8法绘制细胞生长曲线,血球计数法进行细胞计数。结果：心肌细胞最初接种时呈圆形,24小时后细胞贴壁生长;4天后细胞有伪足伸出,细胞呈梭形、多角形等形态,大小均匀,生长迅速,7天后细胞逐渐形成细胞簇,11天后细胞簇相互连接成片生长,达90%融合时进行传代;计数1000个细胞,蓝染细胞48个,成活率为95.20%;生长曲线显示细胞生长过程分为潜伏期、对数生长期和平台期三个阶段。结论：高原环境能够进行体外心肌细胞培养。     

温度调控诱导尼罗罗非鱼仔鱼雄性化的研究

  罗非鱼Oreochromis spp.是我国重要的水产养殖品种。我国是世界最大的罗非鱼生产国和出口国。但罗非鱼性成熟早、繁殖过度,致使商品鱼品质偏低、资源浪费严重,解决途径为采用单雄性养殖。本文进行了温度调控诱导尼罗罗非鱼仔鱼雄性化的研究。较之前常采用的雄激素投喂方式更环保、安全、高效。控温处理开始时期为出膜后第7天（DPH, Days Post Hactching）,进行正交试验：设置3个温度20、28、36 ℃（±0.5 ℃）,3个控温时段7-14 DPH、7-21 DPH、7-28 DPH。主要结果如下：处理组合（温度+控温时段）为36 ℃+7-14 DPH、36 ℃+7-21 DPH、36 ℃+7-28 DPH时雄性率较对照组显著增高、与其它各组有显著差异（P<0.05）,分别高达93.85%、96.00%和96.92%,这3组间无显著差异（P>0.05）。为了解控温对仔鱼的影响,还同步研究了相应的增质量率和存活率。由控温时段结束至60 DPH的绝对增质量率来看：处理组合36 ℃+7-14 DPH、28 ℃+7-14 DPH与对照组无显著差异（P>0.05）;从存活率来看：只有处理组合20 ℃+7-21 DPH、20 ℃+7-28 DPH与对照组有显著差异（P<0.05）。综合来看,最佳处理组合为36 ℃+7-14 DPH,平均雄性率 93.85%、最高达96.96%,且高温（36 ℃）处理后生长和存活不受影响。     

鲈鲤胚胎发育特征观察

观察了水温（18±0．5）℃条件下,鲈鲤[Percocypris pingi pingi（ T chang ）]的胚胎发育特征。结果显示：成熟鲈鲤卵呈球形、桔黄色,为粘性卵,卵径2．2mm,卵膜遇水膨胀后,最大外膜径达3．2-3．8mm。受精卵在水温（18±0．5）℃条件下,受精2h28min后开始第1次卵裂,受精后45h23min开始形成器官,受精后126h28min孵出仔鱼。初孵仔鱼全长为10．4mm,卵黄囊大而侧扁。根据胚胎发育过程的形态特征,可将鲈鲤胚胎发育过程分为受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官发生和出膜7个连续阶段。32个时期。     

加压下采用自主研发保存液及不同保存方法对半月板保存的研究

为探讨加压环境下采用不同保存方式及自主研发半月板保存液对半月板保存的最佳方法,用成年山羊20只,共提供40只半月板,将其随机分为4小组分组保存(A组:①自主研发保存液组(国家发明专利号为:201110188468.4),②UV保存液组,③α-MEM保存液组;B组:梯度降温加-80℃低温冰箱保存),定期取部分半月板组织进行组织学、组织化学、细胞存活率及免疫组织化学检测.A组的自主研发保存液组和B组经过冷冻保存1、3、6、9周后,胶原纤维排列规则、紧密,纤维粗细均匀,横纹清晰.半月板纤维软骨细胞形态基本正常,半月板纤维软骨细胞基质黏多糖含量丰富,细胞存活率较高;A组中UV保存液组、α-MEM保存液组组经过保存后细胞大多出现基质中黏多糖含量降低,细胞器结构不清,细胞存活率低.在所有保存组中,自主研发保存液组半月板保存效果更好.说明自主研发保存液组有利于保持半月板中纤维软骨细胞的活性,对半月板损伤更小.在半月板纤维软骨细胞存活率方面,自主研发保存液组和UV保存液组、α-MEM保存液组的差别有统计学意义(P＜0.05),自主研发保存液组和- 80℃低温保存对维持半月板纤维软骨细胞活性无明显区别,但保存更方便,保护作用更强.     

Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells

Since the first report of live mammals produced by nuclear transfer from a cultured differentiated cell population in 1995 (ref. 1), successful development has been obtained in sheep, cattle, mice and goats using a variety of somatic cell types as nuclear donors. The methodology used for embryo reconstruction in each of these species is essentially similar: diploid donor nuclei have been transplanted into enucleated MII oocytes that are activated on, or after transfer. In sheep and goat pre-activated oocytes have also proved successful as cytoplast recipients. The reconstructed embryos are then cultured and selected embryos transferred to surrogate recipients for development to term. In pigs, nuclear transfer has been significantly less successful; a single piglet was reported after transfer of a blastomere nucleus from a four-cell embryo to an enucleated oocyte; however, no live offspring were obtained in studies using somatic cells such as diploid or mitotic fetal fibroblasts as nuclear donors. The development of embryos reconstructed by nuclear transfer is dependent upon a range of factors. Here we investigate some of these factors and report the successful production of cloned piglets from a cultured adult somatic cell population using a new nuclear transfer procedure.     

Activin is a nerve cell survival molecule

The structures of five neurotrophic molecules have so far been published. Nerve growth factor, fibroblast growth factor and purpurin, have been identified as nerve-cell survival molecules. More recently, brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and ciliary neurotrophic factor have been cloned and sequenced. As all these proteins stimulate the survival of ciliary or sensory neurons, a new cell survival assay is required if novel neurotrophic molecules are to be discovered. P19 teratoma cells differentiate to nerve-like cells in the presence of 5 x 10(-7) M retinoic acid (RA). But when P19 cells are plated in N2 synthetic medium without being exposed to RA, they die within 48 h. In an attempt to identify a molecule(s) that can substitute for RA in promoting P19 survival, we assayed serum-free growth-conditioned media for their ability to promote P19 survival. One cell line from the rat eye secreted a molecule that promoted the survival of P19 cells and some types of nerve cell. We identified this molecule as activin, better known for its role in hormone secretion.