凡纳对虾penaeidin2抗菌肽基因的克隆与性质研究

抗菌肽分子是无脊椎动物先天免疫系统中,直接发挥免疫效应的分子;它在对抗病原细菌侵染的过程中发挥着重要的功能.本文以凡纳对虾对虾素抗菌肽基因penaeidin2作为研究对象,系统地进行了基因克隆、氨基酸序列比对、分子进化关系以及分子结构的初步预测等研究.研究结果显示:Lva-pen 2基因是一个免疫反应相关基因,它在凡纳对虾的先天免疫系统中发挥着重要功能.     

益生素制剂在中国对虾养殖中的应用研究

研究了益生素制剂对中国对虾的作用,抑菌实验表明益生素制剂对对虾致病菌－弧菌有的抑制作用;口服一素制剂可以促进对虾的生长和增重;通过测定对虾血淋巴中的抑菌,溶菌,ＰＯ及ＳＯＤ活力,证实口服益生素制剂可以提高对虾的免疫力。     

“黄海1号”中国对虾抗白斑病的SRAP分子标记

通过SRAP(sequence related amplified polymorphism)分子标记技术,筛选中国对虾抗对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的特异性序列.以中国对虾为对象,将WSSV感病组(人工投喂感染)和抗病组,使用筛选后扩增多态性良好的52对引物对其进行SRAP,并应用生物信息学方法对结果进行分析,共找到11条特异性序列可能与中国对虾WSSV抗性相关.将特异性序列在NCBI公共数据库上进行对比发现:编号为40.3,4.20和25.14的标记序列,分别跟参与表达大西洋鲑的重金属外排蛋白和表达绵羊的免疫球蛋白以及表达斑点叉尾的醛脱氢酶基因的部分序列同源性为93%,100%,87%.标记的特异性序列参与中国对虾表达相应的功能蛋白,不但可以间接提高对WSSV的抗性,而且能作为筛选中国对虾抗WSSV的分子标记进行苗种选育.     

对虾一种杆状病毒的分离纯化及超微结构

从市售的甲壳上带有白斑的冷冻斑节对虾(Penaeus monod on)中提取到一种杆状病毒,并用它感染了活体的中国对虾(Penaeus chinensis) 幼虾和日本对虾(Penaeus japonicus).这2种对虾均发病死亡.从死亡的对虾中再次提纯出此杆状病毒.此种杆状病毒的核酸为DNA,衣壳的主要结构多肽的相对分子质量为49 .8 kDa.通过对此杆状病毒悬液负染片的电镜观察,对其超微结构进行了研究并提出了一种对虾杆状病毒衣壳超微结构的模式图.     

凡纳滨对虾G蛋白Gαs基因的克隆和功能鉴定

寻找并克隆凡纳滨对虾G蛋白α亚基基因,为对虾的生理调控研究提供理论基础.通过简并PCR和RACE技术获得目的基因的全长cDNA序列.将该基因的编码序列克隆到pCMV5表达载体,通过免疫共沉淀实验和胞内cAMP浓度的测定鉴定该基因表达产物的功能.用半定量RT-PCR和Western blotting确定该基因的表达产物在对虾身体各部位的分布.克隆到凡纳滨对虾的G蛋白短式剪切模式Gαs亚基基因,将其表达产物命名为pvGαs-s.pvGαs-s的序列和功能与其它物种的Gαs具有高度保守性.它在对虾身体各部位存在普遍分布,尤其在脑神经和腮中大量表达,在触角、眼等部位也有适量分布.说明pvGαs-s在对虾生命活动中的重要性,为研究对虾的生理调控奠定了理论基础.     

刀额新对虾和日本囊对虾细胞核DNA含量的测定与比较

以刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的血淋巴为材料,以小鸡血细胞核DNA含量(2.50 pg/2c)为参照样,使用Partec PA-I型倍性分析仪并结合外标定法,分别测定了刀额新对虾与日本囊对虾细胞的DNA含量.结果表明,这两种虾的细胞DNA含量分别为小鸡血细胞的1.77倍和1.95倍,换算成绝对含量分别为4.340 pg/2c和4.878 pg/2c.本文讨论了刀额新对虾与日本囊对虾以形态学为特征的分类系统与细胞DNA含量之间的关系,并推测在系统演化上日本囊对虾应比刀额新对虾更为高等.     

定量PCR法判定对虾白斑杆状病毒早期的感染和增殖

对虾白斑杆状病毒又称白斑综合症病毒,是对虾养殖业危害最严重的病原体,至今未找到有效的防治方法.充分了解病毒的分子生物学特性和分子致病机理,是病害防治的根本途径,了解病毒的动态增殖特征是该研究的基础.本文采用定量PCR技术,研究对虾白斑杆状病毒人工注射感染后,早期的增殖规律以及感染致死对虾的病毒累积.并对对虾感染病毒后存活时间与个体大小的关系进行了观察.研究发现初期感染病毒含量有短期下降,然后才呈现递增的过程.死亡对虾病毒累积量大于1011病毒粒子/毫克组织(P<0.01).而在4.6～11.6g范围内,感染对虾存活时间与对虾质量不存在相关性(P>0.2).     

日本囊对虾电压门控钠通道基因克隆与组织表达

利用基因克隆等分子生物学技术,获得日本囊对虾(Marsupenaeus ja ponicus)的电压门控钠通道(voltage-gate sodium channel,VGSC)蛋白的部分eDNA序列,获得的片段核苷酸长度为2 877 bp,可编码954个氨基酸残基,总分子质量约为108.2 ku.与同源蛋白比较结果显示,日本囊对虾的VGSC序列与其他一些物种具有较高相似性,特别是跨膜蛋白结构域具有极高的保守性.基于VGSC氨基酸序列比对绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测日本囊对虾VGSC的组织表达,结果显示VGSC表达与各组织的功能有极其密切的关系.VGSC mRNA在脑神经节中表达量最高,其次为肝胰腺,说明了钠通道在神经信号传导以及调节内分泌中都起到了重要的作用.     

刀额新对虾周期蛋白B基因的分子克隆及序列分析

周期蛋白B(cyclin B)是真核生物细胞周期的一种重要调控原件,通过调节周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclindependent kinase,CKD)的活性可以控制细胞周期.运用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆了刀额新对虾(Metapendeusensis)cyclin B基因.刀额新对虾cyclin B的cDNA全长为1681 bp,5′端非编码区为111 bp,3 ′端非编码区为355 bp,开放阅读框为1215 bp,编码404个氨基酸,平均分子质量为45767.9 u,pl为8.81.Blast比对后发现,其氧摹酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)的同源性达约90％.基于cyclin B序列所绘制的进化树基本上能反映出各物种间的进化关系.半定量RT-PCR结果显示,刀额新对虾的cyclinB基因在不同组织表达中具有明显的组织特异性,在鳃、卵巢和心脏中有较高的表达量,在眼柄神经节和胸神经节中表达量较低.推测该差异性主要与cyclin B在细胞周期中调控细胞分裂的功能有关.     

日本囊对虾Ran基因的克隆表达与蛋白质GTP结合活性分析

在日本囊对虾抑制性差减杂交(suppression subtractive hybrid ization,SSH)研究过程中,首次发现一段经同源比较为Ran基因的部分序列,在抗病日本囊对虾中上调表达.为了进一步探索日本囊对虾Ran基因的功能,通过RACE-PCR的方法克隆得到了日本囊对虾Ran基因全长共1 441个碱基,其中开放阅读框为645个碱基,共编码215个氨基酸,这是首次在海洋无脊椎动物体内克隆到该基因.还将该基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-2中并转化大肠杆菌BL21,37℃下诱导6 h,超声裂解表达菌株,结果表明GST-Ran融合蛋白在大肠杆菌中为可溶性表达,蛋白大小约为50 ku,经纯化得到了纯度大于90%的GST-Ran融合蛋白.随后的GTP结合试验验证了Ran蛋白具有GTP结合活性.     

小鼠LEAP-2成熟肽基因在毕赤酵母中的分泌表达

实验利用已构建的分泌型重组表达质粒pPIC9-mmLEAP-2,氯化锂转化表达宿主菌GS115毕赤酵母;应用表型和PCR技术筛选高拷贝转化株。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS—PAGE分析重组mmLEAP-2表达量,为进一步研究mmLEAP-2的活性奠定了基础。     

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64蛋白的优化表达

研究培养基成份、pH值、接种量、诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达水平的影响.SDS-PAGE电泳分析结果表明:在37℃的LB培养基中培养3h,用终浓度为0.3mmoL/L的IPTG于30℃诱导5h时表达水平最高.苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64重组蛋白在大肠杆菌中的优化表达为深度解析其在病毒感染过程中的功能奠定了基础.     

猪脑心肌炎病毒VR-129 B株VP2重组蛋白的构建表达及其免疫活性分析

为获得大量猪脑心肌炎VP2基因及蛋白研究的细胞模型,构建pDC315-EMCV-VP2真核表达载体,且将其转染到293T细胞,筛选出阳性质粒进行克隆。EMCV VR-129B株VP2基因序列参照GenBank(登录号:X74312),利用RT—PCR方法扩增VP2的全基因序列,将其与质粒pDC315经NheI和XhoI双酶切后连接,构建pDC315-EMCV-VP2重组表达质粒,并将其转染至293T细胞。使用荧光定量PCR方法观察pDC315-EMCV-VP2真核表达载体在细胞中的表达情况。双酶切PCR结果获得大小为780 bp的基因片段,测序结果显示与GenBank上已经公布的同名基因(登录号:X74312)序列片段同源性为100%,重组质粒构建成功。实时荧光定量PCR(QPCR)结果显示,重组质粒转染组与空质粒组之间相比,EMCV-VP2基因的表达量显著上调(P0.001);在荧光显微镜下观察转染细胞,转染成功部分出现较亮绿色荧光,EMCV-VP2基因表达稳定。从转染细胞中提取重组蛋白与EMCV阳性血清和阴性血清进行ELisa反应,具有较好免疫活性。     

昆虫杆状病毒可调控表达系统的初步研究

构建了2株用不同启动子表达tet阻遏蛋白Tet-off,并同时带有tet响应元件及报道基因表达框的重组杆状病毒,研究了其受诱导物(强力霉素)调控表达报道基因的情况.W estern b lot和流式细胞仪分析表明,这两株病毒感染昆虫Sf9细胞后,在有诱导物存在时报道基因egfp表达水平明显高于无诱导物时的表达水平,表明Tet-off可调控表达系统可以用于在昆虫Sf9细胞调控相关基因的表达,这项研究为构建更加有效的可调控杆状病毒表达系统提供了基础.     

新型呼肠病毒S1基因与宿主细胞相互作用的初步研究

摘要 目的 筛选出新型呼肠病毒S1基因和宿主相互作用的关键区段,为后续的宿主受体蛋白筛选工作提供可靠的基础。 方法 将编码全长S1基因,以及N端和C端阅读框分别克隆入真核表达载体pIRSE2-EGFP,转染敏感细胞株鼠成纤维细胞（L929）和人宫颈癌细胞（Hela）后,通过荧光报告基因EGFP的表达分析,筛选出S1基因与宿主细胞相互作用时起决定性影响的区段。 结果 同等量的3种真核表达质粒在单独转染L929时,pGSN质粒转染后荧光表达量最大,pGSC质粒转染后荧光表达量最小。 不同比例混合的pGS与pGSN进行共转染时,pGSN在转染质粒中的比例越高,荧光表达量也越高。 在Hela细胞中的转染结果与L929相同。 结论 新型呼肠病毒R4株的S1基因N端阅读框编码区（62-406bp）在S1基因转染时起关键作用。     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32基因的克隆和表达及其在ELISA检测中的应用

钩端螺旋体 (钩体 )病是一种全球性的人兽共患病。人类感染钩端螺旋体后表现出多种器官和系统病变 ,愈后不良 ;也可垂直传播感染胎儿 ,引起流产。动物中 ,犬钩端螺旋体的感染率较高 ,感染后 ,临床表现多样 ,大多呈隐性感染 ,不发病 ,但钩体在肾脏中长期存在 ,持续随尿液向外排菌。由于钩端螺旋体对人的强致病性 ,以及由动物传播给人引起的严重公共卫生问题 ,因此快速准确地进行钩端螺旋体病的诊断 ,显得尤为重要 ,也是目前钩端螺旋体研究中亟待解决的问题。钩端螺旋体属钩端螺旋体科 ,钩端螺旋体属问号状钩端螺旋体种的成员。目前发现血清型…     

含抗HIV广谱中和抗体2F5、4E10靶基因载体的构建及鉴定

目的:构建含HIV gp120,gp41序列中广谱中和抗体2F5,4E10作用靶基因的载体并进行鉴定,为后期重组载体表达产物诱导产生中和抗体及抗HIV亚单位疫苗的研究奠定基础.方法:根据NCBI中HIV gp120,gp41基因序列中可与2F5、4E10结合的区域设计引物并进行PCR反应,将PCR得到的目的片段插入到载体pET28a中,对重组载体进行PCR鉴定、酶切鉴定及DNA测序.结果:PCR鉴定、酶切鉴定及DNA测序结果证实重组载体构建成功.结论:成功构建了含HIV gp120,gp41序列中广谱中和抗体2F5,4E10作用靶基因的载体.     

腺病毒介导ERK-2基因在生长板软骨细胞中的表达

目的:构建ERK-2基因重组腺病毒载体,检测构建的腺病毒感染原代大鼠生长板软骨细胞的效率以及目的基因的表达。方法:将ERK-2 cDNA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转染E.Col.i B J5183,将筛选、鉴定的重组腺病毒质粒线性化后转染HEK293细胞进行病毒颗粒的包装;流式细胞术检测不同感染复数(MO I)ERK-2重组腺病毒感染原代培养的大鼠肋生长板软骨细胞的效率,W estern b lot检测腺病毒感染的生长板软骨细胞中ERK-2蛋白的表达。结果:成功构建ERK-2重组腺病毒,MO I 50的腺病毒感染原代生长板软骨细胞的效率大于90%,感染的生长板软骨细胞中ERK-2表达显著增加。结论:构建的重组腺病毒可介导ERK-2基因在原代大鼠生长板软骨细胞中高表达。     

pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射抗肿瘤效应的实验研究

目的研究pEgr-Endostatin辐射诱导肿瘤的表达特性及其抗肿瘤作用,为提高临床肿瘤放疗疗效提供实验证据.方法 Western blotting法检测pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射诱导黑色素瘤B16细胞蛋白表达;建立动物模型,用ELISA法检测不同处理组Endostatin的剂量水平,比较不同处理方式的差异.结果 Western blotting法检测结果显示:重组质粒转染的黑色素瘤B16细胞上清中均有Endostatin蛋白表达,而未转染重组质粒的B16细胞和转染空质粒的B16细胞上清中未见Endostatin蛋白表达.ELISA法检测结果表明:体外接受2~10 Gy X射线照射,Endostatin表达水平明显增加,且照射剂量为4 Gy时Endostatin的表达水平最高.2 Gy照射8~72 h后,Endostatin表达水平与假照射组比较明显增加,在48 h时Endostatin表达水平最高.动物实验表明:荷瘤+25 Gy照射组、荷瘤+pEgr-Endostatin照射组、荷瘤+pc DNA3.1+25 Gy照射组和荷瘤+pEgr-Endostatin+25Gy照射组肿瘤生长率显著低于单纯荷瘤组(P0.05#0.01),荷瘤+pEgr-Endostatin+25 Gy照射组亦明显低于荷瘤+25 Gy照射组和荷瘤+pEgr-Endostatin组(P0.05#0.01).结论 pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射能使Endostatin蛋白表达增加,从而抑制血管内皮细胞生长、发挥抗肿瘤作用.     

基因工程菌的发酵条件研究

为了获得商品化基因工程产品，要求所选用的基因工程菌高效表达重组蛋白．然而，随着发酵规模的扩大，诸多因素影响基因工程菌蛋白的表达．成功的大规模发酵有两个问题是重要的．一是质粒的稳定性，二是高密度发酵．本文从理论上阐明了ｐＨ，温度、溶氧、比生长速率等条件对重组蛋白产生影响的研究进展．