用CRISPR/Cas9系统构建原位表达dXPR1-GFP的果蝇品系

XPR1是最近鉴定出的一个原发性家族性脑钙化症(primary familial brian calcification,PFBC)的致病基因,它在果蝇体内的同源基因是CG10483(dXPR1).使用CRISPR/Cas9系统,构建原位表达dXPR1-GFP的果蝇品系,在CG10483终止密码子之前插入绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的编码序列,使果蝇表达dXPR1-GFP融合蛋白.该融合蛋白既可以被CG10483编码蛋白的抗体和GFP的抗体识别又能在激发光下发出绿色荧光,能为dXPR1编码蛋白提供准确的定位,从而为研究XPR1基因的功能提供方便.     

拟南芥翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位研究

探讨了拟南芥的翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位.以Col野生型拟南芥的cDNA为模板,通过高保真KOD扩增酶获得2 363bp的拟南芥转录延伸因子EF1A基因片段,将其与GFP融合后共同连入p1300表达载体,利用农杆菌侵染法将p35S∶GFP和p35S∶EF1A∶∶GFP转入野生型拟南芥中,观察转基因植物细胞中GFP的表达情况.结果显示:p35S∶GFP转基因植物中,细胞核中GFP荧光强度显著高于细胞质中荧光强度,但是在p35S∶EF1A∶∶GFP转基因植物中,细胞核中荧光强度与细胞质中荧光强度无显著差异,说明在进行蛋白翻译时细胞质中的EF1A含量显著高于细胞核中,这也为翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位提供了实验依据.     

SNF1A转基因果蝇的构建

将质粒GH12596中的果蝇SNF1A cDNA用PCR方法扩增，并与pEGFP-N2质粒中的荧光蛋白CFP编码序列连接入果绳转基因载体pUAST上，构建了UAS-SNF1A-GFP质粒，转入果蝇细胞内，利用mini-white标记基因筛选，得到3个独立的转基因果蝇品系，将这些转基因果蝇品系分别定位平衡，并用单果蝇PCR方法加以佐证，然后将转基因品系分别与eyGAL4，actin-GAL4,pGMR-GAL4等3个GAL4果蝇品系交配，在荧光显微镜下检测到该基因在果蝇中的表达，从而确认了用显微注射技术能够得到稳定的转基因果蝇模型，为开展用果蝇GAL4-UAS系统大规模研究基因功能奠定了基础。     

一种检测蛋白质相互作用的双荧光共定位系统

自发荧光蛋白以快捷灵敏、即时检测和无需破坏活细胞的特点在蛋白质相互作用的研究中得到广泛应用.从发光水母Aquoria victoria中分离的绿色荧光蛋白(GFP)和从珊瑚Discosoma sp.中分离的DsRed红色荧光蛋白是自发荧光蛋白的典型代表.本研究开发一种基于GFP和红色荧光蛋白(RFP),并可通过待检测蛋白在细胞内表达的空间位移变化产生共定位的双荧光共定位检测系统.该系统为克服两种荧光蛋白光谱渗漏带来的非特异性结果的干扰,将核仁定位信号(NoLS)和出核信号(ABL)分别连接到RFP和GFP.具有定位信号的GFP和RFP的待检测蛋白对可分别在细胞核内和(或)细胞核外表达,伴随它们的相互作用,荧光共定位的现象会产生在细胞内特定的区域.利用抗凋亡蛋白Bc1-2和Bak-BH3短肽作为蛋白对测试该系统,荧光共定位现象明显,系统灵敏可靠.     

绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定

绿色荧光蛋白是当前在生物及生物医学研究当中应用最为广泛的一种荧光标记蛋白.为开发一种高灵敏度、高特异性以及简单经济的GFP多克隆抗体,并使之适用于在跨物种细胞里表达的GFP蛋白进行检测,本文利用gfp基因cDNA全序列分别构建了带有6×His和GST标签的原核表达载体pET28A-gfp和p GEX-2T-gfp,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞进行诱导表达,而后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表达鉴定,分别获得了相对分子质量为2.6×10~4和5.2×10~4的重组6×His/GST-GFP融合蛋白.将亲和纯化的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1﹕32,000.抗血清依次经Protein A亲和纯化和GST-GFP抗原抗体纯化后,用免疫印迹实验(Western blot)方法检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的GFP,对继续开展GFP相关研究具有重要意义.     

果蝇锌离子转运蛋白Catsup亚细胞定位分析

Catsup是果蝇体内一个功能重要的基因,其突变会导致体内多巴胺含量过高,引起果蝇致死及生殖障碍.绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在确定蛋白的亚细胞定位进而在研究蛋白功能方面起着重要的作用.为了探索Catsup的亚细胞定位进而能够更好地研究Catsup的功能,文章利用基因工程技术和生物学方法,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增Catsup基因全长,与GFP一起连接至pUAST质粒,构建载体pUAST-Catsup-GFP,通过显微注射技术导入果蝇,获得UAS-Catsup-GFP转基因果蝇.通过克隆验证了转基因果蝇构建成功.利用该果蝇进行Catsup的亚细胞定位,确定其定位在高尔基体上,为进一步研究该基因的功能奠定基础.     

应用绿色荧光蛋白标记技术研究钙调激Ⅱ在HeLa细胞中的分布

采用绿色荧光蛋白（GFP）标记技术研究钙离子钙调素依赖性蛋白激毒Ⅱ(CaMKⅡ）在HeLa细胞中的分布，为了研究细胞风钙离子钙调素信号的下游作用物，我们首先构建了CaMKⅡ与GFP的融合基因，磷酸钙沉淀法将pCaMKⅡ－GFP重组载体导入HeLa细胞，通过荧光显微镜观察，发现在细胞间期，CaMKⅡ－GFP融合蛋白主要分布于细胞核中，细胞质中亦有少量分布，这一分布不同于绿色荧光蛋白在间期细胞内的动匀分布，同时讨论了与间接免疫荧光染色方法相比，GFP技术在功能蛋白定位研究上的应用优势。     

LPA对人结肠腺癌Caco2细胞SLC26A3表达的影响

为探讨溶血磷脂酸(LPA)对溶质载体26 A3(solute carrier 26 A3′SLC26A3或DRA)在Caco2细胞中细胞内定位及蛋白表达的影响。采用构建pIRES2-ZsGreen1-SLC26A3质粒,转染Caco2细胞,G418筛选获稳转pIRES2-ZsGreen1-SLC26A3 Caco2细胞。设立未处理的Caco2细胞组(Caco2组)、转染空质粒的Caco2组(NP-Caco2组)、转染SLC26A3质粒的Caco2组(SLC26A3-Caco2组)、LPA处理的转染空质粒的Caco2组(LPA+NP-Caco2组)和LPA处理的转染SLC26A3质粒的Caco2组(LPA+SLC26A3-Caco2组),以LPA与Caco2细胞共孵育12 h为观察时间点(LPA浓度为100μmoL/L),利用细胞免疫荧光实验观察Caco2细胞中SLC26A3的定位分布,Western blot法检测Caco2细胞中SLC26A3蛋白的表达。结果显示,细胞免疫荧光实验观察结果显示LPA+SLC26A3-Caco2组SLC26A3细胞膜定位较SLC26A3-Caco2组的略有增加;Western blot检测结果显示LPA+NP-Caco2组的糖基化SLC26A3蛋白表达量较Caco2组与NP-Caco2组的均增加,有统计学意义(相对β-actin的表达量,LPA+NP-Caco2组vs.Caco2组:0.83±0.446 vs.0.14±0.050,P=0.018;LPA+NP-Caco2组vs.Np-Caco2组:0.83±0.446 vs.0.29±0.032,P=-0.044)。由此可知,LPA可促进SLC26A3在Caco2细胞的细胞膜定位和蛋白表达,从而为LPA作为治疗结肠炎相关性腹泻的候选药物提供更多理论依据。     

A549-KIF4A过表达细胞株的构建与鉴定

非小细胞肺癌A549细胞中驱动蛋白KIF4A的表达量极低.为研究KIF4A在肺癌发生和发展过程中的作用,利用脂质体转染的方法,将p EGFP-KIF4A质粒和p EGFP-C1质粒分别转入A549细胞中,用G418筛选得到单克隆,并扩增得到稳定表达GFP-KIF4A和GFP的细胞株.利用Western Blot以及免疫荧光染色法对得到的细胞株进行鉴定.结果表明:A549-GFP-KIF4A细胞中GFP-KIF4A蛋白的表达水平较高,A549-GFP-C1中仅表达GFP蛋白.免疫荧光检测表明:A549-GFP-KIF4A过表达细胞中GFP-KIF4A荧光融合蛋白的定位与内源KIF4A的定位相同.     

几种诱导昆虫细胞RNA干扰质粒的构建和效果比较

构建了四种可以在昆虫细胞中表达形成dsRNA的质粒,比较了其诱导RNA干扰,抑制目标基因———绿色荧光蛋白(GFP)基因表达的效果.四种质粒都不同程度地抑制了质粒介导的GFP表达,其中尤以单个果蝇hsp70启动子表达反向重复序列,并带有杆状病毒AcMNPV增强子hr5的质粒效果最佳,使GFP表达量下降到原来的3.9%.当用于抑制由杆状病毒介导的GFP表达时,以两个相向排列的AcMNPV ie1基因启动子的构造有明显的抑制效果.这些结果对于在昆虫细胞中有效地利用RNA i研究基因功能有参考意义.     

驱动蛋白分子Kif14细胞内中小体定位的研究

为了探讨决定人体驱动蛋白分子Kif14在细胞有丝分裂末期时定位于细胞中小体的功能域,构建了驱动蛋白分子Kif14各功能域的绿色荧光蛋白(GFP)真核细胞表达质粒,分别转染于人体子宫颈癌细胞He La中.应用聚丙烯酰氨凝胶电泳和免疫印迹法(Western Blot)检测各蛋白的表达情况;应用免疫荧光染色法(immunofluorescence)分别对微管蛋白(Tubulin)、着丝粒相关蛋白(CREST)和DNA染色,荧光显微镜下观察各绿色荧光融合蛋白在有丝分裂末期的亚细胞定位.结果发现,细胞有丝分裂末期,驱动蛋白分子Kif14的N末端GFP融合蛋白定位于中小体(midbody),马达区GFP融合蛋白沿微管分布,杆状尾区GFP融合蛋白以点状分布于细胞质,尾区GFP融合蛋白分布于整个细胞中.由此认为,Kif14驱动蛋白分子的N末端延伸区决定该蛋白分子在细胞有丝分裂末期定位于中小体.     

绿色荧光蛋白基因在木葡糖酸醋杆菌中的表达

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)广泛应用于报告基因、基因的表达与调控以及微生物信号传导.以p MV24穿梭质粒为载体,实现了GFP在木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)中的成功表达.采用PCR技术扩增出绿色荧光蛋白基因,连接至木葡糖酸醋杆菌表达载体p MV24中,构建成功的质粒命名为p MV24-gfp+.采用电转化技术将重组载体导入木葡糖酸醋杆菌中,转化子在荧光显微镜的蓝色激发光下发出绿色荧光,为木葡糖酸醋杆菌趋化性的观察及菌体中运动蛋白的分析提供了重要的理论依据.     

SLC38A3抗体的制备及细胞内定位

从人胎肝cDNA文库中钓取得到SLC38A3全长cDNA序列.利用生物信息学方法对SLC38A3蛋白序列进行分析,根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择一段多肽序列作为抗原用于抗体制备.将该片段克隆到pET-DsbA融合蛋白表达载体上,在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下产生SLC38A3抗原肽.纯化目的蛋白并制备兔抗SLC38A3蛋白的多克隆抗体.利用Western blot鉴定抗体特异性,并初步分析该蛋白在人肺癌细胞A549内的定位.结果显示,成功构建了SLC38A3片段的原核表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,制备了特异性较高的人SLC38A3蛋白多克隆抗体,并证实该蛋白表达于细胞质内.为进一步研究SLC38A3的生物学功能奠定了基础.     

ZP2蛋白在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达

目的:在蛋白质水平确定小鼠卵巢的颗粒细胞内是否表达透明带蛋白.方法:制作小鼠卵巢组织的冰冻切片,免疫荧光实验用抗ZP2抗体检测小鼠卵巢颗粒细胞中是否存在ZP2蛋白,荧光显微镜下对卵巢切片的荧光信号拍照,通过灰度分析评估小鼠卵巢的颗粒细胞中的荧光信号,检测小鼠卵巢颗粒细胞内的ZP2蛋白.结果:实验组卵巢切片颗粒细胞区抗透明带ZP2抗体标记的荧光信号灰度值(1. 88±0. 57)明显比对照组(1. 20±0. 11)强.结论:小鼠卵巢颗粒细胞也表达透明带ZP2蛋白.     

拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白的亚细胞定位

为确定拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan-protein,AGP)的亚细胞定位,克隆了这个基因的编码区,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建融合表达载体,经农杆菌介导转化烟草BY-2悬浮细胞.利用激光扫描共聚焦显微镜,在稳定转化的BY-2细胞表面观察到绿色荧光.研究结果表明,此AGP分布在细胞膜表面.     

GFP-mut2植物表达载体的构建及在甜菊愈伤组织中的表达

构建了GFP－mut2的植物表达载体。在农杆菌的介导下使GFP-mut2基因整合到甜菊核基因组中并得到了表达，从而建立了以绿色荧光蛋白基因为报告的基因的根癌农杆菌介导的甜菊转基因系统。为今后构建GFP融合蛋白及分析相关蛋白的生物学功能奠定了基础。     

表达EGFR与HER2双抗体融合蛋白腺病毒载体研究

构建携带Cetuximab全长抗体与Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)融合蛋白的腺病毒,探讨其在体外表达情况,及其与EGFR和HER2的结合能力.通过PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2一Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法(IFA)检测所表达的融合蛋白与EGFR(+)Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2(+)的SK-OV-3细胞膜结合的特异性.ELISA检测分析表明,AdS-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/mL-317.3 ng/mL;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光(IFA)显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合.成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-Herin,而且AT2-Herin蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合.     

水稻小GTP蛋白OsRab5A的表达、纯化和GTP结合分析

小GTP结合蛋白是一类在细胞内的运输过程中重要作用的蛋白。它们通过结合子GTP而激活 ,当GTP被水解为GDP后处于非活性状态。哺乳动物中的研究表明 ,Rab5A蛋白是细胞内的形成早期内吞体 (earlyendosome)的限速因子。证实了所克隆的水稻rab5A基因编码的蛋白具有GTP结合功能。将Osrab5A基因的编码序列按正确读码框重组到pGEX4T1载体中 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,电泳判定插入片段大小无误后 ,进一步测序鉴定其读码也无误。将该克隆命名为pG_5AE。以IPTG诱导 pG_5AE所编码的融合蛋白GST_OsRab5A的表达。SDS_PAGE电泳与无外源质粒和表达谷胱甘肽硫转移酶 (GST)的对照相比 ,得到了预计大小的融合蛋白。以GSTrapTM亲和柱纯化融合蛋白。在不同的泳道分离纯化的融合蛋白和作为对照的含GST以及无外源蛋白的细菌总蛋白 ,电转移到硝酸纤维膜上。将该膜与α_3 2 PGTP温育 ,洗膜 ,放射自显影后 ,获得了融合蛋白结合GTP的结果 ,这表明在原核中表达出的水稻Rab5A蛋白能在体外结合GTP。     

小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其编码蛋白的细胞内定位

研究了小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其在细胞内的定位.提取小鼠8种组织及处于5个发育阶段的胸腺细胞总RNA,逆转录成cDNA后,利用RS21-C6基因特异性引物,观察了RS21-C6基因的表达;同时构建pEGFP-N3/RS21-C6重组表达载体,在激光共聚焦荧光显微镜下观察了细胞内荧光分布.RT-PCR结果表明RS21-C6基因在所检测的组织和细胞中除骨骼肌和CD4SP胸腺亚群外均有不同程度的表达.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,RS21-C6-GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达在胞浆内,RS21-C6-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.     

马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位

为了研究马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位情况,采用RT-PCR技术克隆到马铃薯StHb1基因cDNA序列,并成功构建了StHb1基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pBI121-StHb1-GFP.利用农杆菌介导法将重组载体转化洋葱内表皮细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白的瞬时表达以确定StHb1蛋白在细胞内的分布.结果表明StHb1蛋白主要分布于细胞核中.