新疆肉用绵羊抑制素βA基因多态性与产羔数关联分析

肉用绵羊的产羔数量低是制约新疆绵羊产业发展的一个重要因素.因此,对绵羊产羔数的分子标记研究也就具有了非常重要的现实指导意义.本研究选择了新疆本地品种哈萨克肉用羊、引进品种萨福克肉用羊和德中杂交肉用羊为实验对象,以抑制素βA基因为产羔数性状的候选基因设计了5对引物,采用聚合酶链式反应-单链构象多态技术(PCR-SSCP)检测该基因多态性,并分析其与产羔数的关联.结果表明:3种绵羊外显子5'调控区引物0-2扩增区域存在多态性位点,有3种基因型,分别定义为:AA、AB和BB.测序发现,基因型AA在外显子1的一43 bp和-44 bp处存在C→A和G→A的连续碱基突变,-38 bp处存在C→A的单个碱基突变,一25 bp处存在C→G的单个碱基突变.显著性分析显示,哈萨克羊基因型AA比基因型AB和BB产羔数分别多0.20个(P＜0.05)和0.26个(P＜0.05),德中杂交基因型AA比基因型AB和BB产羔数多0.25个(P＜0.05)和0.34个(P＜0.05),而萨福克羊3种基因型产羔数差异无统计学意义(P＞0.05).结论:绵羊抑制素βA是影响新疆哈萨克羊和德中杂交肉用羊产羔数的重要基因,可作为标记辅助选择的候选基因.     

藏系绵羊贾洛类群、阿勒泰羊、新疆细毛羊线粒体DNA D-LOOP区遗传多样性研究

为探讨藏系绵羊贾洛类群的起源、进化和遗传多样性,通过对贾洛类群、阿勒泰羊、新疆细毛羊三个群体51只绵羊的线粒体DNA D-LOOP区全序列进行测序分析.结果表明:51条序列长度范围为1032-1331bp,以1181bp为主(含4个75bp重复序列),A％+T％含量大于G％+C％含量,贾洛类群与阿勒泰羊亲缘关系较近,三个绵羊群体有3个独立的母系起源,没有发现羱羊对臧系绵羊贾洛类群、阿勒泰羊、新疆细毛羊起源有贡献的证据.     

盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因克隆及序列分析

为了克隆盘羊与巴什拜羊杂交后代短鄂、肺及鼻咽上皮细胞克隆1(SPLUNC1)基因cDNA全长序列,本研究根据GenBank上已公布的牛、山羊的SPLUNC1基因序列来设计简并引物,以盘羊与巴什拜羊杂交F1代为材料,克隆出盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的片段序列,再利用RACE法克隆其SPLUNC1基因3′端和5′端,测序后拼接获得SPLUNC1基因全长cDNA序列。结果显示,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的cDNA全长为1117 bp,5′非编码区(UTR)为84 bp,3′UTR为265 bp,开放阅读框(ORF)为768 bp,编码255个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点5.006,分子量26.57 kDa。系统进化分析表明,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列同源性最高。本研究克隆了盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因全长cDNA序列,为后续深入研究该杂交后代SPLUNC1基因的功能奠定基础。     

川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中绵羊的PRLR基因序列设计引物,以川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊垂体总RNA为模板,通过RT-PCR技术对川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及进行序列分析,以期为进一步研究该基因与山羊的繁殖性能奠定理论基础.结果表明:川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因编码区均长1746bp,均编码581个氨基酸.川中黑山羊(金堂类群)PRLR基因编码区与藏山羊、绵羊、牛、牦牛野猪和人的同源性分别为99.71%、99%、95%、95%、83%和80%.以核苷酸序列构建分子系统进化树,川中黑山羊(金堂类群)先与藏山羊聚为一类,再与绵羊聚为一类,后与牛和牦牛聚为一类,然后与野猪聚为一类,最后与人聚为一类.     

新疆4个绵羊群体MHC-DRB1基因外显子2多态性的遗传分析

采用PCR-RFLP的方法研究了哈萨克羊、多浪羊、中国美利奴羊(新疆军垦型)及哈萨克羊与中国美利奴羊(新疆军垦型)杂交一代的MHC-DRB1基因外显子2遗传多态性。结果显示,4个绵羊群体的MHC-DRB1基因外显子2表现出丰富的多态性,共检测到28种基因型和14个等位基因,其在4个绵羊群体间的分布存在不一致。对4个群体的遗传参数检测结果显示,MHC-DRB1基因外显子2的基因杂合度较大,遗传变异程度较高。根据MHC-DRB1基因外显子2在5个酶切位点的等位基因频率对4个绵羊群体进行了聚类分析,结果反映了4个群体间就MHC多态性建立的遗传关系,并初步探讨了4个群体间抗病性的相互关系。     

成都麻羊MyoG基因的克隆与测序分析

根据猪MyoG基因的部分序列和绵羊MyoG mRNA设计引物,以成都麻羊、金堂黑山羊、白玉黑山羊和高原型藏山羊基因组为模板,应用PCR技术克隆测定MyoG基因序列．序列分析结果表明,成都麻羊MyoG基因长1957bp,由3个外显子和2个内含子组成,其中外显子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的大小分别为398bp、82bp、122bp．内含子Ⅰ和内含子Ⅱ的大小分别为765bp和589bp．成都麻羊MyoG基因序列与金堂黑山羊、白玉黑山羊和高原型藏山羊的MyoG基因序列进行比对,同源性分别为99．9％、99．7％和99．3％,而它们氨基酸序列的同源性都为100％．这为进一步研究成都麻羊MyoG基因的表达、生物学活性和应用奠定了一定基础．     

乐至黑山羊催乳素受体基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中绵羊催乳素受体（PRLR）基因序列（AF041257.1）设计1对引物,以乐至黑山羊脑垂体总RNA为模板,通过RT-PCR技术对乐至黑山羊PRLR基因cDNA克隆测序和序列分析.结果表明：扩增出的乐至黑山羊PRLR基因cDNA序列长为1743bp,编码581个氨基酸.乐至黑山羊与绵羊、牦牛、欧洲牛、野猪和人的核苷酸同源性分别为：98.34％、94.67％、94.27％、77.48％、74.33％.以核苷酸序列构建分子进化树,乐至黑山羊先与绵羊聚为一类,再与欧洲牛和牦牛聚为一类,而后与野猪聚为一类,最后与人聚为一类.     

山羊KLF17基因克隆与组织表达

克隆山羊Krüppel样因子17基因(KLF17)的c DNA序列,并检测其组织表达水平,为KLF17基因的功能研究奠定基础.随机选取2~3周岁的健康简州大耳羊和藏山羊羯羊各4只,屠宰采集山羊不同组织样品(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪),提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊KLF17基因序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测KLF17基因mRNA的表达水平.结果表明,克隆得到山羊KLF17基因c DNA序列1 450 bp,包含CDS区全长858 bp,5'UTR序列12 bp,5'UTR序列580 bp,编码285个氨基酸残基.其CDS区与牛、绵羊相比在5'端少99 bp,而在531位多出361 bp,这导致其编码区在858位提前终止.山羊蛋白序列较牛、绵羊少113个氨基酸残基.组织表达结果显示,KLF17基因在藏山羊肺中具有最高的表达水平,而在简州大耳羊皮下脂肪中具有最高的表达水平.两种山羊均在背最长肌中具有最低的KLF17表达量.这些结果表明KLF17可能在山羊脂质代谢过程中具有重要调控作用.     

绵羊ISG15基因的克隆表达与纯化

为了克隆并表达绵羊ISG15,且对其表达产物进行纯化,首先从绵羊外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出ISG15的基因;再通过基因克隆技术,构建ISG15在pET28a中的重组表达质粒pET28a-ISG15,在大肠杆菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达,得到ISG15的原核表达蛋白;最后采用Ni 2+-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白。结果显示:克隆的绵羊ISG15基因序列长度为541bp,编码157个氨基酸。重组表达产物通过SDS-PAGE可检测到相对分子质量为25ku的重组蛋白,且表达的目的蛋白能被Ni 2+-NTA亲和层析方法所纯化。该研究为后续深入研究绵羊ISG15奠定基础。     

血管舒缓素基因D19S246重复序列多态性与新疆哈萨克族原发性高血压

探讨了血管舒缓素(kallikrein,KLK)基因D19S246重复序列多态性与原发性高血压(essential hypertension,EH)的关系。应用PCR扩增、毛细管电泳和Genetic Profiler自动分析软件进行微卫星基因组扫描分析,选取新疆哈萨克族EH患者196例,正常血压者94例,检测KLK基因D19S246重复序列多态性。KLK基因D19S246重复序列存在11种等位基因,分布符合Hardy-Weinberg平衡,扩增片段长度为205 bp的A6等位基因最常见。该位点杂合度为0.813,多态信息量为0.809。D19S246重复序列多态性在哈萨克族EH组和对照组的分布无显著差异(χ2=9.097,P=0.523)。结果显示KLK基因D19S246重复序列多态性可能与哈萨克族EH不相关。     

从细胞色素b基因序列分析羚牛分子系统进化

目的分析羚牛分子系统进化,解决多年来关于羚牛分类地位及其与麝牛关系的争论。方法应用聚合酶链式反应(PCR)分别扩增羚牛、绵羊、山羊细胞色素b基因,并对其全序列(1140bp)进行测定。结合GenBank检索序列,对9种偶蹄类动物(麝牛、绵羊、羚牛等)、1种奇蹄类动物(斑马)的细胞色素b基因序列差异进行分析,并基于序列差异构建分子系统树。结果羚牛与羊亚科的动物亲缘关系最近(序列差异分别为9.085%和11.652%),与其他动物亲缘关系较远(序列差异为12.344%~23.333%),与麝牛的差异达到了13.658%。羚牛与绵羊分歧的时间约在360万年前,而与麝牛的分歧时间约在550万年前。结论将羚牛归入羊亚科较为合理,羚牛和麝牛形态和行为上很强的相似性可能是趋同进化的结果。     

从rbcL基因序列研究明福1号及其近似种苏丹草的亲缘关系

本实验通过对明福 1号及其近似种苏丹草的叶绿体 rbc L基因序列的测定和变异位点的分析 ,结果表明 :明福 1号 rbc L序列的 G+ C百分含量为 4 2 .93% ,而苏丹草 rbc L序列的 G+ C百分含量为 4 3.0 9% ;明福1号与苏丹草的 rbc L 序列的变异位点很少 ,仅为 4个 ,分别位于第 12 4 bp、6 41bp、84 9bp、880 bp位点上 ,总变异位点占总性状位点 (96 3bp)的 0 .4 1% ;同时 ,明福 1号与苏丹草的相似系数为 0 .997,表明明福 1号与苏丹草有极高的亲缘关系。     

新疆4个品种绵羊群体遗传结构的研究

采用垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对巴什拜羊(43只)、哈萨克羊(41只)、中国美利奴羊(新疆军垦型)(42只)、罗姆尼羊(45只)的3个血清蛋白位点进行了多态性分析，计算了血清转铁蛋白(Tr)、酯酶(Es)及白蛋白(Alb)的基因型和基因频率及各位点的杂合度、群体平均杂合度及群体信息度。结果表明：4个品种绵羊在3个位点均为多态，在多态座位中，Tr、Alb和Es分别出现了4、3和3种表型，分别受4、2和2个共显性等位基因控制。X^2检验显示，4个品种绵羊在3个座位上均处于哈代-温伯格平衡状态(P≥0．05)，并且均表现出较高的杂合度，其值分别是：巴什拜羊0．588l、中国美利奴羊(新疆军垦型)0．5352、哈萨克羊0．5290、罗姆尼羊0．4964。     

山羊INHA和INHBA基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

分别提取处于同一发情周期的5只低繁藏山羊和5只高繁金堂黑山羊的卵巢、垂体的总RNA,并通过RT-PCR技术对INHA、INHBA基因cDNA进行克隆、序列分析,以Real-time PCR技术对其进行组织表达研究.结果表明:藏山羊和金堂黑山羊INHA基因编码区均长1083bp,编码360个氨基酸,两品种基因编码区有7处碱基不同,并导致3处氨基酸的差异;INHBA基因编码区均长1278bp,编码425个氨基酸,两品种基因编码区有4处碱基不同,并导致1处氨基酸的差异.藏山羊INHA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.4%、98.9%、95.8%、88.6%、81.0%、79.5%和84.8%;藏山羊INHBA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.7%、99.4%、98.1%、91.7%、88.0%、88.5%和91.2%.INHA和INHBA基因mRNA在两个山羊品种的卵巢、垂体中均有表达,但两品种间无显著性差异(P0.05).说明INHA和INHBA基因在动物进化中比较保守,与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究.     

新疆哈萨克族原发性高血压患者人巨细胞病毒流行基因型及变异分析

目的为了解新疆地区哈萨克族及原发性高血压(EH)患者人巨细胞病毒(HCMV)感染流行株的分子流行病学特征,并确定该人群中EH患者HCMV的易感基因型。方法采用病例-对照研究方法,采集新疆塔城地区沙湾县博尔通古乡800例哈萨克族(467例EH患者,333例健康参与者)的外周血标本。使用Real-time PCR、PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)及测序技术检测HCMV-DNA,鉴别gB基因型并构建进化树。结果 107例HCMV活动性感染患者中EH患者占65.4%(70/107),明显高于健康对照组34.6%(37/107)。新疆地区哈萨克族人群中HCMV感染流行株存在3种gB基因型:gB2占37.4%(40/107),混合基因型:gB1+2占47.6%(51/107)、gB2+3占15%(16/107),分布及构成比存在差异; EH患者中存在三种gB基因型:gB2型占37.1%(26/70)、gB1+2占48.6%(34/70)、gB2+3占14.3%(10/70),分布及构成比存在差异;高血压男性中存在三种基因型:gB2型占47.1%(16/34),gB1+2型占47.1%(16/34),gB2+3型占5.8%(2/34);高血压女性中则存在三种基因型:gB2型占27.8%(10/36),gB1+2型占50.0%(18/36),gB2+3型占22.2%(8/36);高血压男性和女性的3种基因型的分布及构成比不存在差异(χ~2=5.049,P 0.05);生物信息学结果发现:23例单一gB基因核苷酸序列差异性在0～11.5%,氨基酸序列差异性在0～13.1%。结论新疆哈萨克族人群及高血压患者中易感基因型为gB1+2和gB2型。且新疆哈萨克族人群中单一HCMV gB基因核苷酸以及氨基酸序列存在变异。     

藏绵羊KAP3.2基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达的研究

为研究藏绵羊角蛋白相关蛋白(KAP3.2)基因结构与功能,揭示该基因的组织特异性表达规律.以藏绵羊为研究对象,分别提取藏绵羊心、肝、脾、肾及皮肤组织中总RNA,并以此为模板,通过RT-PCR技术对藏绵羊KAP3.2基因的c DNA进行克隆、序列分析;利用Real-time PCR技术进行组织表达研究.结果表明:藏绵羊KAP3.2基因编码区全长297bp,编码98个氨基酸;藏绵羊与普通绵羊、山羊、藏羚羊、草原鼠、家鼠、人的相应核苷酸同源性分别为99%、97%、96%、79%、75%、73%;藏绵羊KAP3.2基因在皮肤中高表达,而在其它组织中相对表达量较低,说明该基因的表达具有组织特异性.     

青海省都兰县羊亚科野生动物残体的分子鉴定

DNA条形码(DNA barcode)已被广泛用于野生动物的物种鉴定、身份识别、系统发生等领域的研究。本研究利用DNA条形码技术对青海省都兰县宗加镇收集到的羊亚科野生动物残体进行了分子鉴定。结果表明:在13份羊亚科野生动物残体中成功获得3个样品的细胞色素b(Cytochrome b,Cyt b)基因全长序列,通过生物信息学和系统发育关系分析显示,来自野外分化头骨齿髓和1份皮张样品的Cyt b基因序列与盘羊的基因序列聚在一起,结合都兰县羊亚科动物的分布格局,推测这2个样品可能属于盘羊组织;而来自腿骨骨髓的Cyt b基因序列与岩羊已发表序列聚在一起,共同形成一个单系群,推测腿骨样本可能属于岩羊个体。研究结果揭示,无论是从序列差异还是系统发育关系,细胞色素b基因序列作为DNA条形码均可确切鉴定羊亚科的物种。     

阿勒泰羊、藏绵羊(贾洛类群、欧拉类群)Sry基因序列分析及亲缘关系研究

利用山羊Sry基因设计引物,PCR扩增获得阿勒泰羊、藏系欧拉羊、藏系贾洛羊包含Sry基因整个编码区的雄性特异性片段.经测序及人工校对、剪切获得Sry基因编码区序列.分析结果表明三个类群羊Sry基因序列完全相同,且与其他品种羊具有高度的同源性:阿勒泰羊、藏系贾洛羊、藏系欧拉羊与普通绵羊、盘羊及摩弗伦羊具有相同的Sry基因序列,亲缘关系最近,其次是赤羊,最远是大角羊.这说明,这三个类群羊可能是由中国盘羊经当地居民长期人工选育而成的地方性品种(系).     

流感病毒H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定流感病毒H3N2血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆流感病毒H3N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(52 bp～1 549 bp)、pMET A/NA(121 bp～1 260 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了流感病毒H3N2 HA、NA基因序列,为流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗开发等进一步研究奠定了基础。     

基于线粒体DNA控制区的新疆北鲵种群遗传多样性分析

以线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)控制区为分子标记,对分布于新疆温泉县6处自然栖息地的新疆北鲵(Ranodon sibiricus)遗传多样性进行研究.共采集新疆北鲵尾端肌肉组织样本60份,通过PCR扩增获得853bp的mtDNA序列,含D-loop序列747bp、tRNA-Pro序列72bp及部分tRNA-Thr和tRNA-Pro之间基因间隔区(ISR)序列34bp,其中D-loop序列中A、T、G和C 4种核苷酸所占百分比分别为31.92%,35.04%,15.02%和18.02%,A+T所占百分比为66.96%.经MEGA软件比对发现,所得60个样品的扩增序列(853bp)完全一致,共享一个单倍型,所有扩增序列仅在控制区的第449位碱基(均为A)与GenBank(AJ419960)中新疆北鲵线粒体该位点碱基(为G)不一致.结果表明,国内现存6处自然栖息地内的新疆北鲵遗传多样性极低,在近缘同属种及脊椎动物中都极为罕见,显示该种近期经历过严重的瓶颈效应,可能由一个单倍型扩散至目前的分布格局.研究结果可为该物种保护提供分子遗传学依据.