不同氧浓度对裸鼹鼠原代鼠星形胶质细胞增殖及生长状态的影响

摘要: 目的建立裸鼹鼠星形胶质细胞体外培养方法,观察不同氧浓度对裸鼹鼠星形胶质细胞增殖及生长状态的影响,寻找最适宜体外裸鼹鼠细胞增殖和生长的氧浓度。方法利用机械法辅以化学法分离新生裸鼹鼠脑内胶质细胞,利用差速贴壁法进行星形胶质细胞纯化,通过设置3%、5%、10%以及20%等不同氧浓度环境,利用CCK8 染色法分析不同氧浓度下裸鼹鼠星形胶质细胞增殖速率,利用免疫细胞化学染色法观察不同氧浓度下裸鼹鼠细胞胞体伸长突起的状况从而进一步判断不同氧浓度下裸鼹鼠星形胶质细胞生长状态。结果利用机械及化学法分离裸鼹鼠胶质细胞并结合差速贴壁法能够成功建立体外裸鼹鼠星形胶质细胞模型。不同氧浓度环境下裸鼹鼠生长速率不同,随着氧浓度的升高,裸鼹鼠进入快速生长期所用的时间越短。氧浓度为20%时,裸鼹鼠星形胶质细胞较小,突起少,状态不佳,但是10%以下的氧浓度环境中,裸鼹鼠能保持较多的细胞突起,状态较好。结论机械及化学法相结合,合并差速贴壁法能够成功建立裸鼹鼠星形胶质细胞体外培养模型, 10% 氧浓度下既可以保证裸鼹鼠星形胶质细胞适宜的生长速率又能保证其处于良好的生长状态。     

姜黄素对老年鼠脑内氧化性平衡和星形胶质细胞的影响

以SD大鼠为动物模型,采用Western blotting、酶活性测定、免疫荧光和高效液相色谱-质谱(LC-MS)方法考察姜黄素处理12周后正常衰老大鼠皮层和海马的氧化性平衡和星形胶质细胞形态功能的变化.结果显示,姜黄素降低了老年鼠脑内氧化产物MDA和8-OHdG的含量,提升了γ-谷氨酰胺半胱氨酸合成酶(GCS)的活性并且促进GSH的产生,提示姜黄素可显著改善伴随正常衰老过程的脑内氧化性平衡;同时姜黄素可以抑制胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的过度表达,提升GS活性,增加GDNF水平和D-丝氨酸含量,表明其抑制星形胶质细胞过度活化的同时也改善了星形胶质细胞的功能.     

小鼠脊髓损伤后对少突胶质细胞前体细胞发育的影响

为研究小鼠脊髓损伤后脊髓少突胶质细胞前体细胞的发育分化情况,选择基因型为PDGFRa-creER+/Rosa-tdTomato+小鼠为研究对象,用脊髓损伤仪损伤小鼠脊髓T8或T9段.伤后休养30d取材,通过免疫荧光、激光共聚焦和电镜的方法分析取样材料,发现在物理损伤30d后,大部分表达tomato阳性的细胞同时表达少突胶质细胞的标志蛋白CC1,一小部分细胞同时表达星形胶质细胞的标志蛋白GFAP.     

piRNA-102526参与缺氧/复氧诱导心肌细胞焦亡作用及机制研究

为探究piRNA-102526与心肌细胞焦亡的关系，体外构建小鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧模型，设置3 h、6 h、9 h、12 h、24 h缺氧时间梯度及6 h复氧条件，检测小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡水平。利用qRT-PCR检测piRNA-102526表达水平，Western Blotting检测焦亡相关蛋白(GSDMD、Caspase-1、IL-1β、ASC)表达，PI染色和LDH活性检测细胞死亡。研究结果显示，小鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧6 h/复氧6 h,细胞焦亡相关蛋白表达水平最高。抑制piRNA-102526表达，小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡加剧，过表达piRNA-102526,小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡减少。这表明，piRNA-102526能通过Caspase-1参与经典焦亡通路，调节小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡过程。     

缺氧对体外培养髓核细胞骨钙素水平的影响

研究了缺氧对体外培养髓核细胞骨钙素表达的影响及意义.将人髓核细胞株进行体外培养,在显微镜下观察髓核细胞的生长形态;在传代培养24、48、72 h时分别收集2组细胞,采用免疫组织化学SABC法检测骨钙素的表达,应用图像分析系统进行了半定量检测,光密度值显示:体外培养髓核细胞在48、72 h时,缺氧组髓核细胞OCN表达水平均明显高于常氧组(平均光密度值分别为180.50±8.76 vs 169.29±3.04、190.87±7.06 vs 166.33±4.44,均P0.01),且缺氧组髓核细胞骨钙素表达水平随缺氧时间延长而逐渐升高.常氧组各时间段之间髓核细胞骨钙素表达水平无统计学差异.缺氧可诱导髓核细胞骨钙素的表达上调,缺氧环境下髓核细胞的骨钙素过表达,缺氧可能对椎间盘软骨终板矿化起到促进作用.     

rhEPO对预处理低氧损伤胶质细胞MMP-9表达的影响

 探讨人促红细胞生成素（rhEPO）对低氧损伤胶质细胞的影响及对金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响。通过体外纯化培养第3代星形胶质细胞,将其分为正常组、低氧组、rhEPO预处理组;以四唑蓝（MTT）比色法测定低氧培养12、24、36h细胞的存活率,倒置显微镜和透射电镜观察低氧对胶质细胞形态的影响;免疫荧光和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法研究低氧对星形胶质细胞MMP-9表达的影响。结果显示:低氧组星形胶质细胞在低氧培养下出现细胞肿胀,且随时间的延长而加重,rhEPO预处理组在各时间点细胞肿胀明显轻于低氧组。rhEPO能减轻细胞超微结构的改变及降低MTT比值。RT-PCR及免疫荧光检测表明：低氧组MMP-9 mRNA及蛋白的表达在低氧各时间点均高于正常组,在24h达到最高,在36h开始降低（P<0.05）;rhEPO预处理组MMP-9mRNA及蛋白的表达变化在12、24、36h较低氧组低（P<0.05）。由此得出结论：rhEPO通过抑制MMP-9的表达促进低氧条件下星形胶质细胞的存活。     

中枢神经系统来源的HMGB1表达模式和释放特征

目的:阐明生理病理状态下,中枢神经系统(CNS)来源的高迁移率族蛋白1(HMGB1)细胞定位、亚细胞定位和释放特征.方法:使用Western Blot和细胞免疫荧光双标记法检测HMGB1在细胞株(U87, BV2和N2a)和原代星形胶质细胞、神经元的表达模式和释放特征.用PTX和/或ATP处理培养细胞,Western Blot检测浓缩上清中HMGB1蛋白表达,台盼蓝拒染法检测细胞的生存率.结果:HMGB1定位于U87、BV2、N2a,原代星形胶质细胞和神经元的细胞核,位于目的条带25 KDa位置. PTX和/或ATP能诱导U87和BV2主动分泌HMGB1,N2a细胞被动释放HMGB1.结论:生理状态下,星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元细胞核表达HMGB1,属于HMGB1来源,HMGB1具有CNS释放特征.     

石杉碱甲对急性炎症小鼠室旁核和脑干c-Fos和GFAP表达的影响

目的:探讨石杉碱甲对急性炎症小鼠下丘脑室旁核和脑干神经元c-Fos和星形胶质细胞(astrocytes,AST)胶质原纤维酸性蛋白(glial fiberillany acidic protein,GFAP)表达的影响.方法:①采用蛋清致小鼠足趾肿胀模型,检测致炎后30min,1h,2h的小鼠足容积并计算肿胀度;②免疫组化技术检测孤束核、迷走背核及室旁核神经元c-Fos及星形胶质细胞GFAP的表达.结果:①与生理盐水组比较,不同浓度的石杉碱甲均可明显抑制蛋清致小鼠足肿胀(P0.05或P0.01).②与对照组相比,致炎组小鼠孤束核和室旁核内Fos免疫阳性神经元(Fos-immunoreactive neurons,Fos-IR)及GFAP免疫阳性星形胶质细胞(GFAP-immunoreactive astrocytes,GFAP-IR)数目均明显增多(P0.01),而迷走背核增加不显著(P0.05).与致炎组相比,石杉碱甲给药组孤束核、迷走背核及室旁核内Fos-IR神经元及GFAP-IR星形胶质细胞数目均明显增多(P0.01).结论:石杉碱甲对蛋清致小鼠足肿胀有明显的抗炎作用;石杉碱甲能够显著增强急性炎症小鼠孤束核、迷走背核及室旁核内神经元和星形胶质细胞的活动.     

石杉碱甲对急性炎症小鼠室旁核和脑干c-Fos和GFAP表达的影响

目的:探讨石杉碱甲对急性炎症小鼠下丘脑室旁核和脑干神经元c-Fos和星形胶质细胞(astrocytes,AST)胶质原纤维酸性蛋白(glial fiberillany acidic protein,GFAP)表达的影响.方法:①采用蛋清致小鼠足趾肿胀模型,检测致炎后30min,1h,2h的小鼠足容积并计算肿胀度;②免疫组化技术检测孤束核、迷走背核及室旁核神经元c-Fos及星形胶质细胞GFAP的表达.结果:①与生理盐水组比较,不同浓度的石杉碱甲均可明显抑制蛋清致小鼠足肿胀(P<0.05或P<0.01).②与对照组相比,致炎组小鼠孤束核和室旁核内Fos免疫阳性神经元(Fos-immunoreactive neurons,Fos-IR)及GFAP免疫阳性星形胶质细胞(GFAP-immunoreactive astrocytes,GFAP-IR)数目均明显增多(P<0.01),而迷走背核增加不显著(P>0.05).与致炎组相比,石杉碱甲给药组孤束核、迷走背核及室旁核内Fos-IR神经元及GFAP-IR星形胶质细胞数目均明显增多(P<0.01).结论:石杉碱甲对蛋清致小鼠足肿胀有明显的抗炎作用;石杉碱甲能够显著增强急性炎症小鼠孤束核、迷走背核及室旁核内神经元和星形胶质细胞的活动.     

星形胶质细胞的生物学功能及其与疾病的关系研究进展

星形胶质细胞As为中枢神经系统内多种胶质细胞中的一种.在正常中枢神经组织中,胶质细胞与神经元的比例是10:1~50:1,而星形胶质细胞在脑内数目最多,是中枢神经系统中最主要的大胶质细胞,并具有复杂多样的结构与功能.神经元-星形胶质细胞作为神经系统功能单位,它们之间的相互作用在中枢神经系统中非常重要,参与了中枢神经系统从胚胎发生到老化的各个活动,贯穿了神经元的整个发育过程.随着对中枢神经系统疾病病理机制和治疗手段的深入研究,人们认识到在神经系统发育、突触传递、神经组织修复与再生、神经免疫及多种神经疾病的病理方面都与星形胶质细胞密不可分.对星形胶质细胞的生物学功能及其与疾病的关系进行了较为系统的阐述,以期为相关疾病的临床治疗提供参考.     

大鼠中性氨基酸转运蛋白HA-SNAT3融合蛋白的构建和鉴定(英文)

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT3是SLC38基因家族N系统的成员之一,主要在脑部和视网膜的星形胶质细胞中表达,负责转运谷氨酰胺,在脑部和肝脏的谷氨酸-谷氨酰胺循环中发挥重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达和定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接的方法将HA标签连接到质粒pBK-CMVΔ(1098-1300)-SNAT3中大鼠SNAT3的N端,构建了真核生物表达载体pBK-CMVΔ-SNAT3.用脂质体转染法将该表达载体瞬时转染进人胚肾细胞(HEK293T cells),通过Western blotting检测HA-SNAT3融合蛋白的表达.结果表明,HA-SNAT3能够正确在细胞膜上表达.pBK-CMVΔ-SNAT3表达载体的成功构建对于进一步研究SNAT3的结构和功能提供了有效方法.     

星形胶质细胞低温去分化条件

体外纯化培养的成熟星形胶质细胞经冷冻复苏方法处理后,诱导转化为放射状胶质细胞的类似细胞(RGLCs细胞).星形胶质细胞的诱导转化率与其冷冻过程的温度、时间有关.冷冻保护液中的DMSO对星形胶质细胞的诱导转化过程无关.这些结果显示冷冻复苏方法诱导星形胶质细胞的转化是由物理刺激诱导的.     

槲皮素和芦丁对星形神经胶质细胞氧化损伤及脂质过氧化的抑制作用

黄酮类化合物能稳定和清除自由基,减轻细胞的氧化损伤,起到抗氧化的作用.通过Wistar大鼠星形神经胶质细胞H2O2氧化损伤及大鼠脑脂质过氧化实验,检测了槲皮素及芦丁两种黄酮类化合物的抗氧化活性.结果表明,两种化合物对大鼠星形神经胶质细胞及脑脂质过氧化均具有较强的保护作用,并且槲皮素的活性大于芦丁.     

刺参多糖对星形胶质细胞活化作用机制研究

目的探讨刺参多糖对星形胶质细胞的活化作用机制.方法选取新生Wistar大鼠24只,经胰酶消化分离可得星形胶质细胞;采用MTT法检测HS-4对细胞的毒副作用;采用伊红染色与免疫荧光染色检查细胞的形态学变化;采用Western blot法检测细胞特征蛋白GFAP和细胞周期调控蛋白Cyc DI的表达;采用BrdU法检测细胞的增殖;采用Transwell法检测细胞的迁移.结果 HS-4浓度在0.1～100μg/mL,作用时间为3,5 d时,细胞数量与对照组差异不显著,HS-4浓度在100μg/mL,作用时间为7 d时,细胞存活率明显低于对照组,差异显著;体外培养的细胞与HS-4单独作用,细胞形态无明显改变,HS-4与FGF-2联合作用后,细胞形态发生明显改变;星形胶质细胞的特征蛋白GFAP表达水平显著升高,HS-4在1μg/mL和5μg/mL时,GFAP表达升高了169%和183%;对照组细胞周期调控蛋白Cyc DI表达最低,FGF-2单独作用后,Cyc DI表达略有升高,当HS-4与FGF-2联合作用后,Cyc DI表达明显升高;对照组BrdU阳性率最低,占细胞总数的12.9%,FGF-2单独作用后,BrdU阳性率略有升高,占细胞总数的16.4%,与对照组差异不显著,HS-4浓度为1μg/mL和5μg/mL时与FGF-2联合作用,BrdU阳性率明显升高,占细胞总数的28.5%和56.1%,与对照组相比差异显著;静息状态星形胶质细胞无迁移,HS-4与FGF-2作用下星形胶质细胞迁移明显.结论 HS-4与FGF-2能有效诱导星形胶质细胞的活化,其活化机制主要是强化细胞增殖与迁移.     

缺氧后小鼠脑匀浆提取液对儿童MSCs分化为神经细胞的影响

目的:观察缺氧后不同时段小鼠脑匀浆提取液对儿童骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的影响,为筛选MSCs的最佳移植时间提供依据.方法:制作缺氧小鼠模型;并制取缺氧不同时间段脑匀浆提取液;诱导儿童MSCs;比较MSCs分化为神经元样细胞的阳性率.结果:缺氧后1、4,7、10、13 d小鼠脑匀浆提取液均可将MSCs诱导成神经元样细胞,经免疫学鉴定NES染色强阳性;但各组阳性率不同,以缺氧10 d后阳性率(21.02±3.38)%最高,与其他各组比较有统计学差异(P<0.05).结论:缺氧后小鼠脑匀浆提取液可诱导儿童MSCs分化为神经元样细胞,缺氧后10 d的分化率最高.     

大鼠在空间辨别性学习记忆时海马CA1,CA3区和DG的ACh能纤维和星形胶质细胞的变化

目的通过建立大鼠空间辨别性学习记忆的动物模型,观察大鼠海马CA1,CA3区和齿状回(DG)的乙酰胆碱(ACh)能纤维密度和含量的变化以及星形胶质细胞的数量及其胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达的变化,从形态学上探讨中枢ACh和星形胶质细胞与空间辨别性学习记忆的关系.方法建立空间辨别性学习记忆的动物模型,采用乙酰胆碱酯酶(AChE)的组织化学染色及GFAP标记星形胶质细胞.并用显微镜方格目测系统和图像分析仪对大鼠海马CA1,CA3区及DG的GFAP免疫阳性星形胶质细胞的数量及其GFAP表达进行检测.结果模型组与对照组相比大鼠各观察部位的AChE阳性纤维的密度和含量均增高,有显著性差异(P<0.05).而空白组和游水组相比大鼠各观察部位的AChE阳性纤维的密度和含量均无显著性差异(P>0.05),模型组内各组间两两比较大鼠各观察部位的AChE阳性纤维的密度和含量均无显著性差异(P>0.05);模型组与对照组相比大鼠各观察部位的星形胶质细胞的数量及其GFAP的表达均增加,有显著性差异(P<0.05).而空白组和游水组相比大鼠各观察部位的星形胶质细胞的数量及其GFAP的表达均无显著性差异(P>0.05),模型组内各组间两两比较大鼠各观察部位的星形胶质细胞的数量及其GFAP的表达均无显著性差异(P>0.05).结论在空间辨别性学习记忆过程中,大鼠各观察部位的AChE阳性纤维的密度和含量增高,说明中枢ACh参与空间辨别性学习记忆过程;在空间辨别性学习记忆过程中,大鼠各观察部位的星形胶质细胞的数量及其GFAP表达的增加,说明星形胶质细胞参与空间辨别性学习记忆过程.     

肝细胞生长因子对体外缺血/再灌注星形胶质细胞氧化应激的影响

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)对体外缺血/再灌注导致的星形胶质细胞氧化应激的影响.方法:取体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞,建立缺血/再灌注损伤细胞模型.用HGF预处理星形胶质细胞后,进行缺血/再灌注.测定细胞活力、活性氧簇(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽(GSH)含量.RT-PCR检测细胞Nrf2 mRNA的表达,Western blotting检测胞浆和胞核Nrf2蛋白的表达.结果:星形胶质细胞缺血/再灌注后,细胞活力降低,ROS水平及MDA含量升高,SOD活性及GSH含量降低.Nrf2 mRNA及胞浆、胞核Nrf2蛋白水平均下调.HGF能明显升高细胞活力,降低ROS水平及MDA含量,升高SOD活性及GSH含量,上调Nrf2 mRNA及胞浆、胞核Nrf2蛋白的表达.结论:HGF能减轻体外缺血/再灌注导致的星形胶质细胞氧化应激损伤,可能与HGF调节Nrf2表达及核转位水平、调控氧化/抗氧化系统的平衡有关.     

CNTF在受损星形细胞胶质化过程中的表达及其作用

在培养胶质细胞机械损伤模型上利用RNA探针原位杂交技术研究了睫状神经营养因子(CNTF)mRNA在星形细胞胶质化过程中的表达及其自调控.结果显示,在未划伤组,O-2A前体细胞中CNTFmRNA表达水平高于原浆型星形胶质细胞(Flat-A).损伤后,未划伤区Flat-A及O-2A细胞中CNTFmRNA的表达水平无显著变化,然而在划伤沟两侧的Flat-A细胞中CNTFmRNA表达增加,伸出的肥大细胞质型突起因深染而显得十分明显.加入外源CNTF2h后引起划伤沟两侧及中间未划伤区Flat-A细胞CNTFmRNA表达增加,24h达到高峰,48h后下降到初始水平.以上结果提示,CNTFmRNA在受到损伤的星形胶质细胞中表达增高,外源性CNTF能促进Flat-A细胞CNTFmRNA表达.     

piRNA DQ725559通过抑制心肌细胞铁死亡通路抗心肌缺血再灌注损伤的作用

为探究心肌缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion Injury, IRI)与铁死亡关系,寻找相关Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA,piRNA),利用小鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation, H/R)构建心肌细胞IRI模型,通过细胞生存率反映诱导铁死亡最佳H/R时间点,筛选铁死亡相关piRNA,检测铁死亡相关指标变化。研究结果显示,缺氧18 h/复氧6 h后,心肌细胞铁死亡和IRI呈现关联,抑制DQ725559的表达会加重心肌细胞铁死亡和IRI,过表达DQ725559会减轻心肌细胞铁死亡和IRI。研究结果表明,DQ725559可通过调节心肌细胞铁死亡通路发挥IRI调控作用,过表达DQ725559可成为RNA治疗心血管疾病新策略。     

脊髓中S100b基因的表达模式研究

S100b是一种钙离子结合蛋白,与阿尔兹海默症、帕金森症、神经痛等多种神经系统疾病有关.实验通过原位杂交和免疫荧光技术对S100b在中枢神经系统的表达模式进行直接分析,发现S100b主要表达在脊髓灰质星形胶质细胞和脊髓白质中正在成熟的少突胶质细胞中,表明其并不能很好的作为星形胶质细胞的分子标记物.