piRNA DQ725559通过抑制心肌细胞铁死亡通路抗心肌缺血再灌注损伤的作用

为探究心肌缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion Injury, IRI)与铁死亡关系,寻找相关Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA,piRNA),利用小鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation, H/R)构建心肌细胞IRI模型,通过细胞生存率反映诱导铁死亡最佳H/R时间点,筛选铁死亡相关piRNA,检测铁死亡相关指标变化。研究结果显示,缺氧18 h/复氧6 h后,心肌细胞铁死亡和IRI呈现关联,抑制DQ725559的表达会加重心肌细胞铁死亡和IRI,过表达DQ725559会减轻心肌细胞铁死亡和IRI。研究结果表明,DQ725559可通过调节心肌细胞铁死亡通路发挥IRI调控作用,过表达DQ725559可成为RNA治疗心血管疾病新策略。     

心肌肽素在心肌细胞氧化应激中的作用

研究心肌肽素对过氧化氢所致心肌细胞氧应激模型中所起的作用。采用原代培养乳鼠心肌细胞,以200μmol/L过氧化氢作用2 h诱导心肌细胞造成氧化应激模型,细胞损伤前分别给予不同浓度的心肌肽素进行干预。使用RT-PCR检测Caspase-3表达变化,MTT比色法检测原代乳鼠心肌细胞的活力,黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶活性。过氧化氢组心肌细胞活力低于对照组,超氧化物歧化酶活性下降(P<0.05),caspase-3 mRNA表达升高;心肌肽素组细胞活力、超氧化物歧化酶活性高于过氧化氢组,而caspase-3 mRNA表达水平较过氧化氢组降低(P<0.05),不同浓度心肌肽素之间无明显差别(P>0.05)。心肌肽素对过氧化氢造成的心肌细胞损伤作用有抵抗作用且这种抵抗作用与其抑制凋亡作用有关。     

DFO对心肌细胞铁代谢的影响

观察去铁胺(DFO)对原代培养的心肌细胞铁代谢的影响,探讨DFO对心肌细胞铁代谢的影响机制.用原代培养的乳鼠心肌细胞为材料,以不同浓度的DFO孵育细胞,然后检测心肌细胞存活率、搏动频率以及铁转运相关蛋白CP,HP,FP1的表达变化.结果表明:各剂量DFO对心肌细胞存活率无明显影响;心肌细胞搏动频率减慢,停止跳动的细胞数量明显增加,收缩幅度逐渐降低;随着DFO浓度的增加,心肌细胞CP和HP的表达增加而FP1表达减少.由此可以看出,DFO不影响心肌细胞的存活率,但影响细胞的生活状态,也影响心肌细胞内CP,HP和FP1蛋白的表达.     

黄芪总皂苷对三氧化二砷诱导H9c2细胞损伤的保护作用

为探讨黄芪总皂苷(ASTs)对三氧化二砷(ATO)诱导H9c2细胞损伤的保护作用及其机制,采用6μg·mL^-1ATO孵育12 h建立H9c2细胞损伤模型.实验设空白组、模型组、ASTs低/中/高浓度组,ASTs组预孵育12 h,弃去含药培养基,继续用6μg·mL^-1 ATO孵育12 h,终止实验.通过CCK-8法检测细胞存活率,Hoechst 33342染色法观察细胞凋亡程度,流式细胞术定量测定细胞凋亡率,RT-qPCR测定Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9表达水平,Western Blot测其蛋白.结果表明：ATO能够显著降低心肌细胞存活率、增加凋亡率(P<0.05);与ATO模型组比较,ASTs各组能显著提高细胞存活率,降低细胞凋亡率(P<0.05),降低Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA表达水平,增加Bcl-2 mRNA表达水平(P<0.05),显著降低细胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平(P<0.05),升高Bcl-2/Bax比值(P<0....     

白藜芦醇对心肌细胞缺氧性损伤的作用

本文的目的是观察白藜芦醇(Res)对大鼠乳鼠心肌细胞缺氧性损伤的保护作用.具体是通过建立体外培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧模型,采用MTT法检测心肌细胞活力,相差显微镜观察心肌细胞形态学及细胞搏动频率.结果表明白藜芦醇Res对缺氧诱导的大鼠乳鼠心肌细胞损伤具有良好的保护作用.     

香青兰总黄酮抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用的研究

为研究香青兰总黄酮对体外培养心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用及其机制。采用体外原代培养Wistar大鼠乳鼠心肌细胞建立H/R损伤模型,实验分为正常组、模型组、香青兰总黄酮高、中、低剂量组及丹参滴丸阳性药物对照组。采用MTT法测定香青兰总黄酮对心肌细胞的毒性作用;比色法测定培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的含量;HE染色法检测细胞形态;免疫组化法测定Bcl-2、Bax蛋白表达。结果表明,香青兰总黄酮各给药组均能降低心肌细胞损伤程度,与模型组比较,香青兰总黄酮高、中剂量组均能够明显降低MDA含量(P0.01,P0.05),降低LDH释放量(P0.01,P0.05),增加Bcl-2表达,减少Bax表达;香青兰总黄酮高剂量组可以提高SOD活性(P0.01),降低CK释放量(P0.05)。香青兰总黄酮对大鼠心肌细胞H/R损伤有保护作用,其作用机制可能与清除氧自由基和调节凋亡蛋白的表达有关。     

黄芪丹参配伍提取物对受损心肌细胞能量代谢的影响

为证实以黄芪、丹参为代表的益气活血类中药可有效改善缺血性心肌能量代谢,通过原代心肌细胞在缺氧/复氧条件下复制模型后分为对照组、模型组、曲美他嗪组、黄芪、丹参配伍提取物高、中、低剂量组,并予以相应药物干预。结果表明:黄芪、丹参配伍提取物可减轻心肌细胞损伤、改善心肌细胞活力、增强心肌细胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、肝激酶B1(LKB1)和钙调素依赖性蛋白激酶的激酶β(Ca MKKβ)信号通路蛋白和基因的表达。可见益气活血类中药代表黄芪与丹参配伍使用具有调节脂代谢紊乱,增加心肌能量供给的良好作用。     

FGF-2对大鼠心肌细胞保护作用的机制

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)在内质网(ER)应激中对心肌的保护作用.方法:建立SD大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,使用衣霉素(TM)建立SD大鼠心肌细胞内质网应激模型.观察对照组与FGF-2及牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)治疗组细胞凋亡情况,并使用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组心肌细胞活力.Western blot和实时荧光定量核酸扩增(q-RTPCR)检测各组内质网应激相关分子的表达.结果:缺氧/复氧可引起心肌细胞内质网应激增加,与缺氧/复氧组相比,FGF-2预处理组及TUDCA预处理组内质网应激减弱;FGF-2和TUDCA均能改善缺氧/复氧引起的心肌细胞凋亡及活力减弱;FGF-2能够抑制TM诱导的内质网应激;与TM处理组相比,FGF-2预处理组心肌细胞凋亡减弱,细胞活力改善.结论:缺氧/复氧及TM均可以通过内质网应激诱导心肌细胞损伤,而FGF-2可以通过抑制内质网应激而保护心肌细胞.     

Se-scFv-B3对过氧化氢诱导的大鼠乳鼠心肌细胞损伤的保护作用

用H₂O₂损伤大鼠乳鼠的心肌细胞建立氧化应激损伤模型, 考察谷胱甘肽过氧化物酶模拟物Se-scFv-B3对H₂O₂诱导的大鼠乳鼠心肌细胞氧化损伤的影响. 结果表明, Se-scFv-B3能部分增加心肌细胞存活率, 减少细胞凋亡, 恢复线粒体膜电位, 下调Caspase-3活力并降低细胞内活性氧的含量. 表明Se-scFv-B3可以保护心肌细胞抵制H₂O₂诱导的氧化应激损伤.     

瓜蒌皮水提物通过PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制缺血缺氧大鼠原代心肌细胞的凋亡

以激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路、抑制心肌细胞凋亡为切入点，探究瓜蒌皮水提物(TP-W)保护心肌缺血的机制.分离大鼠心肌细胞，通过缺氧气体+无血清培养液培养制造缺血缺氧损伤模型，以模拟急性心肌缺血时的体内心肌细胞环境；同时添加PI3K特异性抑制剂(LY294002)和TP-W处理细胞，利用倒置相差显微镜观察细胞形态，噻唑兰法、末端标记法分别检测细胞存活率及凋亡率，免疫荧光联合免疫印迹方法定位、定量地检测细胞内PI3K、Akt及eNOS蛋白表达及磷酸化水平.结果显示：对上述缺血缺氧损伤的心肌细胞，TP-W可显著改善其生长状态、提高存活率、降低凋亡率；同时显著上调上述3种蛋白表达水平及磷酸化水平，但磷酸化水平均可被LY294002处理显著削弱.可见，激活PI3K/Akt/eNOS信号通路、抑制心肌细胞凋亡可能是TP-W抗心肌缺血的重要机制，也是中药“开胸除痹”的关键生物学内涵.     

Ghrelin通过诱导细胞自噬加剧H9c2细胞缺氧复氧损伤

用CoCl₂诱导H9c2细胞缺氧损伤24 h后,再将培养基换成新鲜培养基,以模拟心肌细胞体外缺血-再灌模型,并在此基础上通过ghrelin对细胞自噬的调节来评价ghrelin对心肌细胞缺氧-复氧损伤的调节作用.用流式细胞技术和LDH活性检测细胞凋亡和坏死.WST-1检测细胞活力;DCFH2-DA探针评估细胞内活性氧水平;用Western blotting检测细胞自噬.研究结果表明ghrelin处理的缺氧-复氧损伤细胞活力降低、LDH活性、细胞凋亡、ROS含量及自噬增加,用3MA处理后可明显抑制细胞自噬,并伴随细胞活力的显著升高,因此,ghrelin通过加强细胞自噬加剧了CoCl₂诱导的H9c2细胞缺氧-复氧损伤.     

PP2A Cα敲除小鼠心肌细胞模型的构建

体外构建PP2A Cα敲除的原代小鼠心室肌细胞模型.选择性地将雄性PP2A Cαfl/fl,Cre/-小鼠与雌性PP2ACαfl/fl,Cre/-小鼠交配.新生小鼠心脏经胰酶消化后差速贴壁获得原代小鼠心室肌细胞,用带有Cre的腺病毒侵染心肌细胞,经荧光显微镜观察和Western-blot检测,分析PP2A Cα的敲除效果.将基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的雌雄小鼠进行交配,得到其同样基因型的后代,进而可获得足量基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的原代小鼠心肌细胞.用带有重组酶Cre的腺病毒侵染细胞48 h后,可见带有绿色荧光的心肌细胞;Western-blot检测显示,PP2A Cα在Cre腺病毒侵染的心肌细胞可下调60%～80%.本研究成功建立了PP2A Cα敲除的原代小鼠心肌细胞模型.     

PPARα对高糖高脂培养的乳鼠心肌细胞凋亡的影响

探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）的核内激活对高糖高脂培养的乳鼠心肌细胞凋亡的影响．将培养的乳鼠心肌细胞分为：（1）正常组（N组）;（2）高糖组（G组）;（3）高脂组（L组）;（4）高糖高脂组（H组）;（5）高糖高脂＋Wyl4643组（I组）;TUNEL法和流氏细胞术检测细胞凋亡,免疫细胞化学法检测各组细胞PPARα蛋白的表达部位,Westernblotting检测各组细胞PPARα蛋白的表达程度．结果：H和L组凋亡细胞增多（与N组比较P〈0．01）,PPARα蛋白表达有所增加（与N组比较P〈0．05）,胞核阳性染色深;I组心肌细胞的凋亡数目较之H和L组下降（P〈0．01）,胞核PPARa蛋白表达有所增加（与H,L组比较,P〈0．05）．结论：胞核PPARα的表达增高可抑制高糖高脂培养的心肌细胞凋亡,有可能参与机体对高糖高脂血症的自我保护过程。     

运动通过Parkin抗凋亡通路抑制AD小鼠海马细胞凋亡

目的:探讨Parkin抗凋亡通路在运动调控AD小鼠海马细胞凋亡过程中的作用。方法:购3月龄APP/PS1转基因AD小鼠共12只,适应性喂养后把实验小鼠随机分为转基因运动组(TE,N=6)和转基因对照组(TC,N=6),选同系野生型小鼠作为正常对照组(C,N=6)。TE组给予10周的跑台运动,C组和TC组安静饲养。运动结束后取海马组织,用RT-PCR法检测各组小鼠海马Parkin、NEMO、OPA1、Caspase-3、cyt-c、Caspase-8、Caspase-6mRNA表达情况。结果:APP/PS1转基因小鼠海马内Parkin、NEMO、OPA1mRNA表达显著降低,cyt-c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA表达显著升高。与TC组相比,TE组小鼠海马cyt-c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA表达水平显著降低,而Parkin、NEMO、OPA1mRNA表达显著增高。结论:10周中等强度的跑台运动通过激活Parkin-NEMO-OPA1抗细胞凋亡通路,下调AD小鼠海马cyt-c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA的表达,增强AD转基因小鼠海马神经细胞抗凋亡能力。     

内脂素对心肌细胞ICAM-1和VCAM-1及相关因子的影响

为阐明内脂素(Visfatin)在心肌细胞炎性反应中对黏附分子ICAM-1和VCAM-1表达的影响及分子机制,利用原代培养心肌细胞在脂多糖(LPS)刺激发生炎性反应的基础上,检测了Visfatin对ICAM-1和VCAM-1表达的影响,并进一步检测了Visfatin对NF-κB以及NF-κB抑制蛋白Ⅰ-κB及磷酸化的影响.结果表明:Visfatin对LPS诱导的原代心肌细胞炎性因子ICAM-1和VCAM-1的表达具有显著的促进作用,而这一过程是通过促进Ⅰ-κB的磷酸化,增加NF-κB p65的核转移,启动下游的黏附分子mRNA转录和蛋白的表达实现的.     

重组GATA4腺病毒的构建及心肌细胞感染

利用AdEasy腺病毒表达系统构建了GATA4基因过表达腺病毒.编码大鼠GATA4基因的目的片段克隆入pAdTrackcmv质粒,pAdTtrackcmv-GATA4穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转入含pAdEasy-1的BJ5183菌进行同源重组.pAdEsay-GATA4重组质粒经卡那霉素抗性筛选及PacⅠ酶切鉴定.pAdEsay-GATA4转入293A细胞进行包装,产生具有感染性的重组病毒.Ad-GATA4重组病毒感染HeLa及乳鼠心肌细胞,通过免疫印迹及实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测GATA4表达及促心肌肥大效应.Ad-GATA4重组病毒感染乳鼠心肌细胞后,诱导心肌细胞表面积明显增加,ANF表达明显增强.结果表明,Ad-GATA4腺病毒成功感染心肌细胞并诱导了大鼠心肌肥大表型的出现.     

牛磺酸对高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响及其机制

探讨牛磺酸对高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响及其作用机制,以H9c2心肌细胞,分3组:正常对照组(CN组,葡萄糖浓度为5.5 mmol·L~(-1))、高糖组(HG组,葡萄糖浓度为25.5 mmol·L)、牛磺酸干预组(TAU组,葡萄糖浓度为25.5mmol·L~(-1)基础上加终浓度为40 mmol·L~(-1)牛磺酸)。48 h后,采用MTT检测心肌细胞活力,荧光酶标仪检测胞内ROS含量,RT-PCR法检测PI3KmRNA表达量,ELISA法检测磷酸化Akt蛋白(phospho-Akt,p-Akt)蛋白含量,比色法检测Caspase3水平,并采用Annexin-V/PI结合流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:高糖诱导48 h后细胞活力下降(P0.001),ROS含量升高(P0.001),PI3KmRNA水平与p-Akt蛋白含量降低(P0.001),Caspase3活性升高(P0.001);并伴有凋亡率显著增加(P0.001);与HG组相比,牛磺酸干预可显著提高细胞活力(P0.001),降低ROS含量(P0.001),增加PI3KmRNA表达(P0.01)与p-Akt蛋白含量(P0.05),降低Caspase3活性(P0.001),抑制细胞凋亡(P0.001)。说明牛磺酸可通过PI3K/Akt途径降低细胞内氧化应激水平和Caspase3活性,抑制高糖诱导H9c2心肌细胞的凋亡。     

木犀草素抑制AngiotensinⅡ诱导的心肌细胞肥大

摘要 目的 研究木犀草素对血管紧张素Ⅱ诱导乳鼠心肌细胞肥大的作用。方法 用1到3天新生大鼠分离心肌细胞;用徕卡倒置显微镜抓获心肌细胞图像以测量细胞直径;用BCA蛋白检测法测定心肌细胞蛋白质含量;以[3H]苯丙氨酸掺入法测定心肌细胞的蛋白质合成率。结果 0.1 μM血管紧张素Ⅱ引起了心肌细胞直径、蛋白含量和心肌细胞蛋白质合成速率的显着增加。木犀草素预处理可剂量依赖性的减小由Ang II刺激而引起的乳鼠心肌细胞直径、蛋白质含量和蛋白质的合成速率增加。结论 结果表明,木犀草素可有效抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。     

Sigma-1受体激活减轻心脏缺血再灌注损伤

[目的]研究sigma-1受体的激活与抑制对心脏缺血再灌注损伤的作用.[方法]C57BL/6小鼠经过3 d尾静脉注射sigma-1受体抑制剂BD1047, sigma-1受体激动剂SA4503或生理盐水后施行心脏缺血再灌注手术.术后对小鼠心脏进行TTC/Evans蓝双染色并计算心脏梗死区(infarction area, INF)与危险区(area at risk, AAR)比值(INF/AAR),同时对心肌组织采用蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2, Bax, Caspase-3的表达水平.[结果]接受了sigma-1受体抑制剂BD1047预处理的小鼠,其INF/AAR值远大于对照组(P 0.05),心肌组织中促凋亡相关蛋白的表达水平升高,抗凋亡相关蛋白的表达水平降低.而接受sigma-1受体激动剂SA4503预处理的小鼠,其INF/AAR值远小于对照组(P 0.05),心肌组织中促凋亡相关蛋白的表达水平降低,抗凋亡相关蛋白的表达水平升高.[结论] Sigma-1受体的激活能够改善心脏缺血再灌注损伤,而抑制sigma-1受体则会加重心脏缺血再灌注损伤.     

重组Nkx2．5腺病毒的构建及心肌细胞感染实验

利用AdEasy腺病毒表达系统构建了Nkx2．5重组腺病毒．Nkx2．5基因克隆入pAdTrackcmv质粒,pAdTtrackcmv—Nkx2．5经Pme I线性化后转化含pAdEasy-1的BJ5183菌进行同源重组,以构建pAdEsay-Nkx2．5重组质粒．pAdEsay—Nkx2．5转染293A细胞进行病毒包装．以Ad-Nkx2．5重组腺病毒感染Hela及乳鼠心肌细胞,检测了Nkx2．5蛋白表达及对下游ANF和β-MHC基因的表达调控;并采用感染病毒的H9c2心肌细胞经H2O2处理建立细胞凋亡模型,采用噻唑蓝法和荧光染色法检测了细胞存活率和凋亡细胞的形态变化．结果显示,Nkx2．5过表达能抑制H2O2诱导的H9c2细胞凋亡．