中国部分地方牛种mtDNA D-loop区全序列的遗传多样性与系统进化分析

利用PCR测序及生物信息学分析技术,对我国5个地方黄牛品种、5个地方水牛品种及2个地方牦牛品种的mtDNA D-loop区全序列进行PCR扩增以及核苷酸多样度、单倍型多样度分析,发现中国地方黄牛、水牛与牦牛具有丰富的遗传多样性.对试验牛mtDNA D-loop区全序列与牛亚科代表性物种黄牛、水牛、家牦牛、野牦牛、欧洲普通牛、印度瘤牛以及摩拉水牛相应序列进行系统发育分析.结果显示:黄牛与牦牛的亲缘关系较近,它们与水牛的亲缘关系较远;中国水牛属于沼泽型水牛,也有少量江河型水牛渐渗入中国水牛群体;中国黄牛为普通牛和瘤牛的混合母系起源;进化树显示高原牦牛与野牦牛的亲缘关系较近,环湖牦牛与家牦牛的亲缘关系较近.     

牦牛INHBA基因的克隆及序列分析

根据GenBank检索到的普通牛的INHBA基因序列设计一对特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛INHBA cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:扩增片段1360bp,包含1277bp的编码区,编码426个氨基酸.与普通牛相比,牦牛INHBA基因编码区存在2处碱基转化.牦牛与普通牛、绵羊、人、鼠和猪的核苷酸序列同源性分别为99.84%、97.97%、91.41%、87.79%、91.94%,氨基酸序列同源性分别为99.53%、98.82%、95.77%、93.88%、93.88%.蛋白质结构分析显示,INHBA蛋白不易形成α螺旋和跨膜结构,是相对保守的疏水性蛋白.     

藏绵羊脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR、T-A克隆技术获得了藏绵羊H-FABP基因, 并对克隆序列进行分析. 结果显示, 藏绵羊H-FABP编码基因全长402bp, 编码133个氨基酸. 将藏绵羊H-FABP基因及氨基酸序列分别与Gene Bank中公布的山羊、水牛、家牛、野牦牛、猪、马、狗7种动物进行序列一致率比对, 结果显示, 藏绵羊与所选的7种动物的H-FABP基因序列一致率在90.8%～99.5%之间, H-FABP氨基酸序列一致率在93.2%～100%之间. 其中, 藏绵羊与藏山羊H-FABP基因存在2个位点核苷酸差异:114位碱基位点A→G和第129位碱基位点T→C, 但两个位点的核苷酸差异均为同义密码子, 藏绵羊与山羊H-FABP氨基酸无差异.     

人类及部分实验动物MHC-DRB3.2基因核苷酸序列同源性分析

目的研究人类及部分实验动物DRB3.2基因核苷酸序列的同源性。方法利用PCR技术扩增得到牛的DRB3.2基因片段,并测定其核苷酸序列;从GenBank中下载人类、猕猴、绵羊、山羊、猪的相应基因片段;利用DNAMAN软件进行碱基组成分析、同源性分析和构建分子进化树。结果所分析的物种该基因片段大小为267bp,没有发现碱基的缺失以及插入现象;A、T、G、C四种碱基以及G+C的含量在不同物种之间相差较小。就某种动物来说,G的含量最高,T的含量最低,G+C的含量要明显高于A+T含量;人类与猕猴、绵羊、山羊、牛、猪的同源性分别为91.8%、82.8%、82.4%、81.3%、81.6%。结论不同物种MHC-DRB3.2基因核苷酸序列的同源性都比较高;在研究人类有些疾病时,猕猴是其它实验动物不可替代的;DRB3.2基因是研究生物进化和系统发育分析的一个理想遗传标记。     

牦牛牛病毒性腹泻病毒P20和P14基因的克隆及序列分析

参考GenBank中多个BVDV毒株基因组序列,利用生物软件primer5.0设计两对引物,扩增出BVDV牦牛株 P20基因和P14基因.结果表明,克隆得到的P20基因序列为504 bp,与GenBank上发表的BVDV P20大小一致,P14基因序列为312 bp,与GenBank上发表的BVDV毒株比较有6个插入碱基.核苷酸序列的同源性及系统发生分析的结果表明,牦牛(Yak)株属于BVDV-1.     

3种鲍16S rDNA基因片段序列的初步研究

本文对引自日本的盘鲍（Haliotis discus discus)、皱纹盘鲍（H.discus hannai)和大鲍（H.gigantiea)3个自然群体的线粒体DNA 16S rRNA基因片段进行了扩增和测序，分析了528bp的碱基序列，结果显示：3种鲍的基因序列中A＋T含量为56.74%-57.12%。3个自然群体间碱基片段序列差异不显著，盘鲍与皱纹盘鲍、大鲍彼此均仅有1处核苷酸检测到变异，皆为碱基转换，同源性为99.81%；皱纹盘鲍与大鲍有2处碱基转换，同源性为99.61%。16S rRNA基因在鲍属内表现出很高的保守性。     

黑线仓鼠催乳素受体（PRLR）基因部分序列的克隆与序列分析

采用基因克隆方法首次扩增出黑线仓鼠催乳素受体（Prolactin Receptor,PRLR）基因5’端部分序列（GenBank登录号为EU826030）,测序结果表明该片段的有效长度为379bp,包含部分5’调控区、exonl及部分intron1．该序列与其它物种相应区域的同源性比较结果：黑线仓鼠与人、大鼠、小鼠、狐猿、黑猩猩、类人猿PRLR基因核苷酸序列的同源性为82．1％-93．4％;exon1序列的同源性为79．8％-91．4％．系统进化分析与物种亲缘关系的远近一致,同时证明PRLR基因exon1有较大的可变性,因此认为成功克隆了黑线仓鼠的PRLR基因的部分序列．该研究所得到的PRLR基因序列可用作研究物种亲缘关系或遗传距离的理想标记．     

黑线仓鼠AVP基因部分序列的系统进化及结构分析

根据GenBank中黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）同源物种的AVPcDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术得到了黑线仓鼠精氨酸加压素（AVP）基因部分cDNA序列,包括外显子2的全部序列和外显子1、3的部分序列,共433bp,并注册到GenBank（登录号：JN227681）。该段序列共编码143个氨基酸,二级结构预测显示片段中含较多的a螺旋。该序列与其他物种相应区域的比较结果表明其同源性为84％～92％,氨基酸序列同源性为82％-93％。系统进化分析结果与物种亲缘关系的远近一致,该序列的克隆为研究AVP的表达调控机制奠定了基础,将有助于AVP的作用机制的研究及功能分析,同时该cDNA序列可作为物种亲缘关系或遗传距离研究的理想标记。     

牦牛α-乳清蛋白基因5''''-非翻译区部分序列测定及PCR-RFLP分析

用PCR方法扩增了麦洼牦牛α-乳清蛋白基因5'-非翻译区的部分序列.该序列与普通牛的相应序列具有很高的同源性(98.1%),但存在8个碱基差异,碱基突变类型包括1个缺失,5个转换和2个颠换.应用PCR-RFLP方法分析了麦洼牦牛和九龙牦牛α-乳清蛋白基因-1689位单碱基的多态性,结果在该位点没有检测到多态性.     

山羊INHA和INHBA基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

分别提取处于同一发情周期的5只低繁藏山羊和5只高繁金堂黑山羊的卵巢、垂体的总RNA,并通过RT-PCR技术对INHA、INHBA基因cDNA进行克隆、序列分析,以Real-time PCR技术对其进行组织表达研究.结果表明:藏山羊和金堂黑山羊INHA基因编码区均长1083bp,编码360个氨基酸,两品种基因编码区有7处碱基不同,并导致3处氨基酸的差异;INHBA基因编码区均长1278bp,编码425个氨基酸,两品种基因编码区有4处碱基不同,并导致1处氨基酸的差异.藏山羊INHA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.4%、98.9%、95.8%、88.6%、81.0%、79.5%和84.8%;藏山羊INHBA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.7%、99.4%、98.1%、91.7%、88.0%、88.5%和91.2%.INHA和INHBA基因mRNA在两个山羊品种的卵巢、垂体中均有表达,但两品种间无显著性差异(P0.05).说明INHA和INHBA基因在动物进化中比较保守,与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究.     

乐至黑山羊催乳素受体基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中绵羊催乳素受体（PRLR）基因序列（AF041257.1）设计1对引物,以乐至黑山羊脑垂体总RNA为模板,通过RT-PCR技术对乐至黑山羊PRLR基因cDNA克隆测序和序列分析.结果表明：扩增出的乐至黑山羊PRLR基因cDNA序列长为1743bp,编码581个氨基酸.乐至黑山羊与绵羊、牦牛、欧洲牛、野猪和人的核苷酸同源性分别为：98.34％、94.67％、94.27％、77.48％、74.33％.以核苷酸序列构建分子进化树,乐至黑山羊先与绵羊聚为一类,再与欧洲牛和牦牛聚为一类,而后与野猪聚为一类,最后与人聚为一类.     

牛亚科3个主要家养牛种MyoG基因多态性及其遗传分化

对普通牛(鲁西牛、渤海黑牛)、天祝牦牛和中国广西水牛的MyoG基因部分核苷酸序列变异进行了分析,旨在揭示不同牛种群的DNA多态性及其遗传分化.采用PCR和DNA直接测序技术获得4个牛群体的MyoG基因exon 1和5’侧翼部分序列,与GenBanK公布的牛亚科动物同源序列作比对分析.结果显示,在渤海黑牛和牦牛未发现多态位点;鲁西牛存在1个多态位点,定义了2个单倍型;水牛有6个突变位点,但群内只发现1个多态位点.核苷核苷酸多样性(Pi)在0.000 00～0.001 35之间,说明群体内遗传多态性程度较低。核苷酸歧义度(Dxy)以水牛与鲁西牛之间比较最高,为0.013 97,表明水牛遗传分化明显.种系进化树分析表明,牦牛与普通牛亲缘关系很近,二者与水牛关系较远,支持将牦牛归为牛属(Bos)的一个亚属或一个种的观点.     

南阳黄牛CD14基因扩增及序列分析

根据GenBank发表的荷斯坦奶牛CD14基因的序列设计引物,通过PCR方法对南阳黄牛的CD14基因进行分段扩增并测序,拼接后得到包含CD14完整编码区以及5’端和3’端非编码区的2 969 bp的全序列。序列分析结果表明:南阳黄牛CD14基因开放阅读框全长966 bp,共编码321个氨基酸,碱基组成分别为A(18.4%)、T(18.4%)、C(32.9%)、G(30.2%),编码区与荷斯坦奶牛CD14基因相比发生了2个碱基突变,没有引起氨基酸的改变。在5’端和3’端存在较长的非编码区,与荷斯坦奶牛CD14基因相比发生了7个碱基突变。南阳黄牛的CD14基因与荷斯坦奶牛、水牛、绵羊、山羊、猪、猕猴、大猩猩、人、小鼠的同源性依次降低,分别为99.8%、98.2%、96.8%、92.8%、83.5%、79.8%、79.7%、79.5%、71.9%。进化树所得的聚类结果与传统的分类结果一致。通过蛋白质结构预测,发现南阳黄牛CD14没有跨膜结构域。     

牦牛、犏牛和黄牛生产性能比较及肉中风味物质测定

随机选取青海省1．5岁左右牦牛（♂）、犏牛（♂）和黄牛（♂）各3头,利用高效液相色谱法对其肉中的肌苷、肌苷酸和硫胺素进行测定,采用高氯酸滴定法测定其肉中谷氨酸钠的含量,并对牦牛、犏牛和黄牛的生产性能进行比较分析。结果表明：①犏牛的体重和体高明显优于同龄牦牛（P〈0．05）,而且犏牛的体长与牦牛具有极显著差异（P〈0．01）,犏牛和黄牛的胸围都与同龄牦牛具有显著差异（P〈0．05）。②犏牛的头重明显高于同龄牦牛（P〈0．01）;犏牛的皮重、前二蹄重、后二蹄重、胴体重和胴体肉重明显优于同龄牦牛（P〈0．05）;犏牛和黄牛的胴体骨重都与同龄牦牛具有显著差异（P〈0．05）;三个品种的屠宰率、净肉率和胴体产肉率无显著差异（P〉0．05）;黄牛的骨肉比明显高于同龄犏牛（P〈0．05）。③牦牛肉中肌苷含量最高,其含量明显高于同龄黄牛（P〈0．05）;肌苷酸的含量在三品种间无显著差异（P〉0．05）;犏牛肉硫胺素的含量明显高于同龄黄牛（P〈0．05）;黄牛和犏牛肉谷氨酸钠的含量显著高于同龄牦牛（P〈0．05）。     

牦牛SRY和TRO基因部分序列克隆与测序分析

对牦牛SRY和TRO的部分基因克隆和序列分析,以期为牦牛X精子和Y精子鉴定、性染色体的基因定位以及分子标记辅助选择研究提供理论依据.从牦牛和西门塔尔牛冷冻精液中提取DNA,用特定引物对SRY、TRO基因部分序列进行扩增并进行TA克隆和测序.结果表明,这两个基因区域在牛种中有极高的保守性,牦牛与普通牛SRY和TRO基因这两个区域的核酸同源性分别高达99.08%和99.39%.     

小麦SBEⅡb基因的克隆及其与PDS基因串联VIGS载体的构建

为探讨以PDS基因为指示基因利用VIGS技术研究小麦SBEⅡb基因的功能,本研究拟构建小麦SBEⅡb和PDS的双基因串联VIGS重组载体。根据GeneBank中公布的小麦SBEⅡb(AY740401.1)和PDS(FJ517553.1)基因序列分别设计搭桥引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡb和PDS基因的特异片段,利用SOE-PCR技术获得双基因融合片段SBEⅡb:PDS。然后以BSMV:γ-PDS为原载体,通过酶切连接,用SBEⅡb:PDS基因片段将原载体中的PDS基因片段进行替换,从而构建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体。结果显示克隆的SBEⅡb和PDS基因片段长分别是181和190 bp,SBEⅡb:PDS片段长是370 bp。序列分析表明:SBEⅡb基因片段与小麦SBEⅡb(AY740401.1)序列同源性为97%;小麦PDS基因片段与PDS(AF155217.2)序列同源性也为97%;酶切鉴定结果表明成功构建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体。本研究构建的BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体将在PDS基因的指示下为下一步利用VIGS技术在小麦上研究SBEⅡb基因与小麦淀粉合成的关系奠定了基础。     

尖塘鳢属鱼类线粒体16SrRNA基因序列变异及分子系统进化

为探讨尖塘鳢属鱼类的系统发育关系,笔者通过PCR法得到云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢和尖头塘鳢的线粒体16SrRNA基因部分序列（569bp）,并结合从GenBank中下载的平头沙塘鳢、溪鳢及刺盖塘鳢的16SrRNA基因部分同源序列,分析了6种塘鳢科鱼类的系统发育关系．运用MAGA4．0软件分析可知,塘鳢鱼类6个种之间存在142个变异位点,其中简约信息位点57个,转换／颠换之比为1．6,表明塘鳢科鱼类16SrRNA基因序列转换／颠换未达饱和;6种塘鳢科鱼类之间的序列差异在0．054～0．147之间,其中平头沙塘鳢和刺盖塘鳢的序列差异最大（0．147）,线纹尖塘鳢与云斑尖塘鳢的序列差异最小（0．054）,且种间序列差异不大．通过NJ,ME,MP系统树的建立,表明线纹尖塘鳢与云斑尖塘鳢的亲缘关系最近,且尖塘鳢属与塘鳢属鱼类的同源性不高,验证了传统分类学把尖塘鳢独立成属的科学性．     

单增李斯特菌新疆临床分离株毒力基因的克隆和序列分析

为了研究单增李斯特菌新疆羊源临床分离的4b血清型菌株(简称LM90)毒力基因的变异情况,参考Genbank上收录的单增李斯特菌4b血清型菌株F2365(GeneBank登陆号AE017262)的Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因序列,分别设计引物,对LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的最大开放阅读框进行PCR扩增,回收基因序列,连接到PMD19-T载体上进行克隆,筛选阳性菌进行序列的测定,将序列提交到NCBI上(登录号分别为KF826613、KF826614、KF826611、KF703749、KF826612),测序后用DNAMAN软件对序列进行分析。结果显示:LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ与F2365毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的同源性分别为98.04%、96.53%、98.20%、96.41%、98.23%,氨基酸的同源性分别为99.73%、99.83%、98.67%、99.66%、99.76%,可见单增李斯特菌新疆临床分离株LM90毒力基因Ami、Auto、InlB,InlC、InlJ序列相对稳定。