威灵仙水提物对卵形鲳鲹源溶藻弧菌的抑制作用

近年来水产养殖行业不断扩大,但随之而来的鱼病对养殖行业造成了巨大损失。本研究以卵形鲳鲹(前期发病)上分离出的溶藻弧菌为实验对象,批量筛选多种中草药,选择抑菌效果最好的一种或几种中草药,并探究不同浓度中草药水提物的抑菌效果,确定其杀菌浓度(MBC)及最小抑菌浓度(MIC),再通过生化指标胞内乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)的含量来确定其杀菌机制。对大量中草药水提物的筛选结果表明,威灵仙水提物对溶藻弧菌具有较好的抑制作用;通过二倍稀释法将威灵仙水提物进行逐级稀释后,发现其对溶藻弧菌的致死浓度为500 mg/mL,最小抑菌浓度为250 mg/mL;孵育2 h后,实验组胞内LDH的含量明显比对照组含量低,并且随着时间的推移,对照组含量先升高后降低,而实验组含量逐渐减少,实验组与对照组胞内LDH含量出现显著性的差异。威灵仙水提物致死溶藻弧菌有可能是通过破坏细胞膜,使细胞内容物释放从而引起菌体裂解。     

广西北部湾大宗海水养殖鱼类卵形鲳鲹感染溶藻弧菌及其致病性研究

【目的】2016年广西钦州湾近海网箱养殖的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)发生以体表皮肤溃烂、皮下出血、内脏器官病变为典型症状的细菌性疾病,通过对患病卵形鲳鲹中病原菌进行分离、鉴定与保存,为后续开展病原菌快速检测技术和防控技术等研究,以及控制相关病原菌在海水养殖中的暴发和流行奠定基础。【方法】利用LB平板和TCBS平板从患病卵形鲳鲹体表溃烂病灶、肾脏、肝脏组织中分离纯化疑似病原菌,并对其进行常规形态特征和生理生化反应的生物学检验,通过16SrDNA基因测序对疑似病原菌株进行分子生物学鉴定,在细胞和鱼体水平开展病原菌的致病性研究,同时进行人工感染的回接试验。【结果】分离得到4株疑似病原菌(TOQZ01,TOQZ02,TOQZ03,TOQZ04),基于其表型、分子生物学特征和进化关系,判定4株菌株均为弧菌属的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),且细胞毒性试验和回归试验证实,分离得到的溶藻弧菌为此次卵形鲳鲹发病的病原菌。【结论】溶藻弧菌是引起广西沿海地区海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一,未来将基于本研究中分离得到的溶藻弧菌开展病害快速检测技术和防控技术等现代海水生态健康养殖关键技术研究,以实现对广西海水养殖溶藻弧菌病的快速诊断、实时监控和有效预防。     

基于核酸适配体吸附检测技术的卵形鲳鲹源溶藻弧菌的快速检测

溶藻弧菌是引起广西等华南沿海地区海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一,其引起的鱼病具有发病迅速、死亡率高、流行面广等特点,严重威胁着华南地区水产养殖业的健康可持续发展。着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的水产致病菌快速检测技术,对于及早发现、确定病原,进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失意义重大。在先前研究中,我们基于指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology,SELEX)筛选获得特异性识别卵形鲳鲹源溶藻弧菌的核酸适配体,本研究中我们基于核酸适配体VA8开展溶藻弧菌的快速检测诊断技术的研究,开发出一种新型的能够快速检测溶藻弧菌的核酸适配体吸附检测技术(Aptamer VA8-based enzyme-linked aptasorbent assay,VA8-ELASA),并对VA8-ELASA技术检测溶藻弧菌的特异性和灵敏性进行分析研究。VA8-ELASA技术可以用于溶藻弧菌的快速检测,具有特异性强、灵敏度高的特点。本研究基于核酸适配体VA8建立的新型核酸适配体吸附技术(VA8-ELASA),有望实现对广西卵形鲳鲹养殖中溶藻弧菌病的快速诊断、实时监控和有效预防。     

广西莪术水提物对卵形鲳鲹细胞免疫力的影响

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是我国重要的海水养殖鱼类,经济价值极高,但近年来各种鱼病频繁爆发造成了巨大损失。为探究广西莪术(Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang)水提物对卵形鲳鲹免疫力的影响,本文在细胞水平上,利用卵形鲳鲹肾脏组织细胞系研究广西莪术水提物的细胞毒性,以确定其细胞安全浓度。然后利用卵形鲳鲹细胞系研究广西莪术水提物对总一氧化氮合酶(T-NOS)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶等卵形鲳鲹细胞免疫相关酶的影响。结果表明,广西莪术水提物的细胞安全浓度为≤5mg/mL,广西莪术水提物对卵形鲳鲹细胞的免疫相关酶活力(总一氧化氮合酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶)有明显促进作用。广西莪术有潜力发展成为一种高效的水产免疫增强剂,并且基于传统壮药积极开展绿色无药物残留的新型抗水产病害中药制剂的研究,对于促进水产养殖业持续健康发展,确保水产品质量和食品安全意义重大。     

广西卵形鲳鲹小脑来源细胞系的建立及特征分析

【目的】卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是广西重要的海水经济鱼类,但近年来随着养殖规模扩大,各种病害侵染引起的疾病频繁暴发,给广西卵形鲳鲹养殖产业造成重大损失。建立卵形鲳鲹小脑来源的细胞系(Cell line from cerebellum of Trachinotus ovatus,TOCC),将有利于广西卵形鲳鲹养殖中病毒性病害的分离、鉴定和病害的侵染致病分子机理的研究,以及环境污染和变化的动态监测。【方法】采用胰蛋白酶消化法分离得到卵形鲳鲹小脑组织的原代细胞,并进行原代培养。待原代细胞铺满单层后进行传代培养。对稳定传代的TOCC进行18SrDNA基因测序分析,然后进行生长速率分析和染色体分析,并开展病原菌(溶藻弧菌Vibrio alginolyticus)胞外产物对TOCC的毒性分析。【结果】稳定传代的TOCC为成纤维样细胞,18SrDNA基因分析结果显示其来源于卵形鲳鲹;染色体核型分析发现TOCC具有二倍体特征,特征染色体数目为62条;不同培养条件下TOCC细胞的生长速率不同,28℃生长速度最快;病原菌胞外产物对TOCC具有明显的毒性。【结论】本研究成功建立广西卵形鲳鲹小脑组织来源的细胞系(TOCC)。细菌胞外产物对TOCC细胞毒性结果表明,该细胞系在一定范围内能够替代活体检测,实现体外细胞水平对广西海水养殖中病害侵染和环境污染物的快速检测,为养殖病害的有效预防提供技术支持。     

卵形鲳鲹源创伤弧菌导致宿主细胞凋亡的作用机制

弧菌是自然界菌群中的一部分,作为一种有害菌不仅可以感染常见的水产品,有些弧菌更是对人体有一定的致病性。随着近些年水产养殖的不断扩大,由创伤弧菌(Vibrio vulnificus)引起的鱼病不胜枚举,不仅给养殖行业造成巨大的损失,同时对人类生命安全也存在着巨大威胁。本文对卵形鲳鲹源创伤弧菌感染宿主细胞的机制进行研究,目的是阐明创伤弧菌对宿主细胞的致死机理,为未来研发抗病菌功能产品提供理论依据。本文通过确定创伤弧菌胞外产物(Extracellular products,ECPs)的蛋白浓度,以不同的蛋白浓度为基准,利用光镜观察和细胞活力CCK检测技术测定创伤弧菌ECPs对细胞的毒性。然后使用Hoechst 33342染核观察及DNA ladder来进一步确定其致死机制。根据细胞毒性结果,卵形鲳鲹源创伤弧菌ECPs对宿主细胞有很强的细胞毒性。Hoechst 33342染核结果发现实验组出现了凋亡小体,这与STS处理的阳性对照组中细胞变化相一致。但是ECPs处理后的宿主细胞未出现明显的DNA ladder。卵形鲳鲹源创伤弧菌对宿主细胞具有明显的毒性,再通过理化性质的检测,可以初步确定创伤弧菌导致卵形鲳鲹细胞死亡是通过凋亡途径发生的。未来将针对凋亡途径的具体通路进行深入研究,为控制病菌的感染提供理论依据。     

鲑点石斑鱼细菌病原的分离鉴定和致病性

对海南省三亚地区网箱养殖的发病鲑点石斑鱼 (Epinephelusfario)进行病原分离 ,通过常规细菌学鉴定和应用ATB半自动鉴定系统及VITEK_AMS_6 0自动微生物鉴定系统 ,并与有关的标准菌株为对照 ,鉴定为溶藻弧菌 (Vibrioalginolyticus)。小鼠毒性实验和不同方式感染鲑点石斑鱼实验的结果表明 ,该菌对小鼠有极强的毒力 ,不同感染方式感染鲑点石斑鱼表现不同程度的致病性。同时测定了溶藻弧菌对小鼠和鲑点石斑鱼的LD50 分别为 3 2× 10 5个 /mL和 2 1× 10 7个 /mL。进一步比较溶藻弧菌对青石斑鱼 (Epinephelusowoara)、真鲷 (Pagrosomusmajor)、平鲷 (Rhabdosargussarba)、黑鲷 (Sparusaurata)、红鳍笛鲷 (Lutjanuserythopterus)、黄斑蓝子鱼 (Siganusoramia)等一些常见海水养殖鱼类的致病性 ,该菌能导致不同海水养殖鱼类死亡并表现一定程度的症状。     

迷迭香酸对三种常见细菌抑菌活性的研究

迷迭香酸是一种植物来源的天然化合物,具有抑菌活性.以三种金黄色葡萄球菌、托拉斯假单胞杆菌和单增李斯特菌为研究对象,检测迷迭香酸对其最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)和杀菌曲线.实验结果表明,金黄色葡萄球菌25923的MIC和MBC分别为:1.0和1.5mg/mL;金黄色葡萄球菌8325-4的MIC和MBC都是1.5mg/mL;金黄色葡萄球菌ATCC29213的MIC和MBC分别为:1.5和2.0mg/mL;托拉斯假单胞杆菌MIC和MBC均为:2.0mg/mL;单增李斯特菌MIC和MBC为:1.0和1.5mg/mL.     

10种单味中药对养殖鳗鲡主要致病菌的抑制作用

应用超微粉碎法将虎杖、石榴皮、马齿苋、苦楝皮、大黄、紫花地丁、黄芩、五倍子、金银花以及黄连10种中药进行加工处理至粒径为5~10μm后,作用于本实验室近年来从福建各地养殖场收集的患病鳗鲡中分离得到的18株常见致病菌,并利用琼脂稀释法测定其抑菌作用.结果表明:上述10种中药单用对除B12以外的17株养殖鳗鲡主要致病菌均有一定的抑制作用,其平均抑菌浓度(MIC)范围为0.165~128 mg/mL,平均杀菌浓度(MBC)范围为0.210~128 mg/mL.药效较好的5种中药对供试17株菌的MIC值均在2 mg/mL以内,MBC值均在3 mg/mL以内.     

肉桂酸及其衍生物的抑菌活性研究

通过琼脂渗透法和最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC/MFC)的测定发现了肉桂酸及其衍生物(p-甲氧基肉桂酸和p-羟基肉桂酸)对常见几种代表菌具有较强的抑制作用.结果表明,p-羟基肉桂酸对细菌类抑菌效果最好,对枯草杆菌的MIC为0.5 mg/mL,MBC为0.75 mg/mL.对真菌类,肉桂酸的抑菌效果最好,对白色假丝酵母菌的MIC为0.125 mg/mL,MFC为0.5 mg/mL.本文通过研究肉桂酸及其衍生物对常见几种菌的抑菌活性,阐明了它们之间的构效关系.     

艾草抑菌抗炎作用研究

研究艾草（Artemisia argyi）水煎液的抑菌抗炎作用。用试管二倍稀释法和牛津杯法测定艾草水煎液的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）、最低杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）和抑菌直径；用乙酸致小白鼠毛细血管通透试验、二甲苯致小白鼠耳肿胀试验及小白鼠棉球肉芽肿增生试验测定艾草抗炎效果。结果表明艾草具有一定的抑菌抗炎作用，艾草对大肠杆菌的MIC和MBC分别为0.125和0.25 g/mL；艾草水煎液（1.0 g/L）对大肠杆菌的抑菌圈直径为16.622 mm，为高度敏感。艾草高、中、低浓度组对小白鼠毛细血管通透性增高的抑制率分别是29.107%、27.143%和16.607%；艾草高、中、低浓度组对小白鼠耳肿胀抑制率分别是25.045%、21.779%和5.082%；艾草高、中、低浓度组对小白鼠肉芽肿增生抑制率分别是19.990%、9.101%和2.611%。这表明艾草具有一定的抑菌抗炎作用，且抑菌抗炎作用在有限范围内随药物浓度增加而增加。     

陆英有效部位抗菌活性研究

本实验利用陆英全草为研究对象,采用甲醇超声法和乙醇回流法对陆英干燥全草的有效成分进行提取,并将提取物分别用石油醚、乙酸乙酯和水萃取得到不同极性的萃取物组分。通过比较粗提物和萃取相的抑菌活性初步确定陆英的抗菌有效部位。结果显示乙醇回流法的提取率较高,但甲醇超声法提取物活性更好。其中甲醇超声法石油醚萃取物活性最优,对大多数G⁺及其耐药菌的最低抑菌浓度值达0.625~5.0 mg/mL。本研究初步确定甲醇超声法提取物的石油醚萃取部位是陆英的抗菌作用有效部位,这为陆英的药用开发,尤其是其抗菌领域的深入研究奠定了基础。     

半枝莲抗菌活性及其有效部位研究

目的研究半枝莲不同粗提物的体外抗菌活性,并初步确定其抗菌活性有效部位。方法采用甲醇冷浸法、乙醇热回流法及微波萃取法提取粗提物,96孔板培养法测定不同粗提物对的体外抑菌活性;将提取物分别用石油醚、乙酸乙酯和水萃取得到不同极性的萃取物组分,通过比较其抑菌活性初步确定半枝莲的抗菌有效部位。结果三种提取方法中,微波萃取法浸膏得出率最高;半枝莲的各粗提物对普通菌在2 mg/mL下未见抑制活性,但对耐甲氧西林金葡菌(ATCC33591和43300)半数抑制浓度(MIC值)达到2mg/mL;粗提物的萃取组分尤其是乙酸乙酯相,表现出广谱抗菌活性,其对各种菌株的半数抑制浓度大多在0.5～2 mg/mL范围,石油醚相对变异链球菌的抑菌活性较强,MIC值达到0.125 mg/mL。结论半枝莲具有广谱的抗菌活性,尤其是对耐药菌表现出较好的抗菌活性,并且初步确定抗菌有效部位为乙酸乙酯相,这为半枝莲抗菌应用的下一步研究奠定了基础。     

犁头草抗菌活性及其有效部位研究

本实验将犁头草全草作为研究对象,采用不同方法对犁头草全草的有效成分进行提取,评价并比较各提取物的抗菌活性。并将粗提物按照极性高低分布在石油醚、乙酸乙酯和水相中,评价不同萃取相的抗菌活性。结果显示,乙醇回流法和甲醇冷浸法获得的提取物抗菌活性明显,而水煎煮得到的提取物几乎未见抗菌活性。此外,乙酸乙酯萃取相的抗菌作用要优于石油醚相,而水萃取相抗菌活性最小。甲醇冷浸法和乙醇回流法获得的乙酸乙酯萃取组对金葡菌ATCC 33591和金葡菌ATCC 43300的抗菌活性最佳,最小抑菌浓度（MIC）值达到0.3125 mg/mL,对其他细菌的MIC值在0.3125~1.25 mg/mL之间;而其他萃取组分对金葡菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌以及耐药菌的MIC值大约在1.25~5 mg/mL之间。本研究确定了犁头草具有广谱的抗菌活性,尤其对耐甲氧西林金葡菌效果较好。研究发现乙醇回流与甲醇冷浸法可用于犁头草的抗菌物质提取,且它的抗菌有效部位为乙酸乙酯萃取相。     

木芙蓉叶抗菌活性及其有效部位研究

采用乙醇回流法对木芙蓉叶粉末进行活性成分提取,用不同极性溶剂（石油醚、乙酸乙酯和水）对粗提物分别进行萃取。采用连续稀释法评价粗提物及其萃取组分对多种细菌的抗菌活性。结果显示乙酸乙酯和石油醚层萃取组分的抑菌活性良好,对各种菌株的最低抗菌浓度（MIC）在1.25~5 mg/mL之间。其中,石油醚萃取组分对枯草芽孢杆菌CMCC 63501的最小抗菌浓度达到0.625 mg/mL,抗菌效果最佳。乙酸乙酯萃取组分对四种耐药菌株也表现出较好的抗菌活性,其MIC值达到1.25或者2.5 mg/mL。本研究初步确定木芙蓉叶乙醇提取物具备广谱的抗菌活性,其有效部位为石油醚与乙酸乙酯萃取相,这为木芙蓉叶抗菌成分的提取分离及抗菌产品的开发提供了科学的理论及实验依据。     

Microcalorimetric investigation of effect of berberine alkaloids from Coptis chinensis Franch on intestinal diagnostic flora growth

The inhibitory effect of three berberine alkaloids (BAs) from Coptis chinensis Franch, a traditional Chinese medicinal (TCM) herb, on Bifidobacterium adolescentis growth was investigated by microcalorimetry. The power-time curves of B. adolescentis with and without BAs were acquired, meanwhile the extent and duration of inhibitory effect on the metabolism were evaluated by the growth rate constant (k), half inhibitory ratio (IC₅₀), maximum heat-output power (P _max), peak time of maximum heat-output power (t _p) and total heat production (Q _t). k, P _max and Q _t decreased, and t _p was prolonged with the increase of BAs concentration. The IC₅₀ of BAs is 806 μg/mL for berberine, 341 μg/mL for coptisine and 236 μg/mL for palmatine. The sequence of antimicrobial activity of BAs is berberine < coptisine < palmatine. Combined with previous studies, it could be shown that the sequences of antimicrobial activity of BAs on both Bacillus shigae and Escherichia coli are berberine > coptisine > palmatine. The structure-function relationship of BAs indicates that the functional group methylenedioxy or methoxyl at C2 and C3 might be the major group inducing the activities of BAs on E. coli and B. adolescentis. Meanwhile, the substituent groups at C2, C3, C9 and C10 almost have equal effect on B. shigae. Supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 30625042 and 30873385) and Key Projects of National Science & Technology Pillar Program of China in the 11th Five-Year Period (Grant No. 2007BAI40B05)