RNA干扰技术的研究进展

RNA干扰是指由外源双链RNA与其细胞内同源mRNA特异结合引起基因沉默现象,广泛存在于动、植物等各种生物体内,是目前分子生物学领域研究的热点之一。我们简要综述了RNA干扰发生的机制、特点以及RNA干扰的应用等。     

RNA干扰及其在植物上的应用研究进展与展望

RNA干扰是21世纪的研究热点之一,该技术目前已经在植物的基因组功能分析、抗病性的研究以及生长发育的调控等方面得到应用.对RNA干扰机理、生物意义及其在植物上的应用进行扼要综述,探讨RNA干扰存在的问题,并展望其发展和应用前景.     

植物病毒的反RNA干扰机制

RNA干扰(RNAi)是个古老而保守的机制,其作用如同“基因组的免疫系统”,广泛存在于真核生物真菌、植物、动物中,是天然的抵御病毒侵袭的系统.植物病毒在和植物长期而复杂的协同进化中,为了生存繁殖,提高自身复制、运动、感染寄主的能力,也演化出了对付宿主沉默反应的机制,即反干扰机制.目前的研究表明,病毒编码沉默抑制子是反干扰机制的最主要方式.本文主要就病毒编码的沉默抑制子作用特点和功能进行了概述.并介绍了缺损干扰RNA及卫星RNA的特殊复杂二级结构、快速复制与运动躲避沉默信号等反干扰机制,以及探讨了病毒反干扰的研究应用前景.     

RNA干扰的研究现状与应用前景

RNA干扰(RNAi)是dsRNA介导的特异性基因表达沉默的现象,是生物在进化上高度保守的基因表达调节机制之一。从RNA干扰的概念入手,系统阐述了RNA干扰的作用机制、作用特点及其最新进展,并对RNA干扰技术的应用前景进行了展望。     

核糖核酸酶Ⅲ超家族与RNA干扰

核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)是一个在生物体中普遍存在的酶类,它具有把RNA前体加工成有功能的RNA、参与RNA干扰和其它细胞活性的功能.RNaseⅢ超家族包括大肠杆菌的核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)、酵母核糖核酸酶t1(Rnt1)、植物中的核糖核酸酶Dicer和哺乳动物中的核糖核酸酶Drosha,它们都具有在特定位点或者特定的序列区域识别和切割双链核糖核酸(dsRNA)的能力.对RNaseⅢ超家族的种类、结构和功能、作用机制及其在RNA干扰中所起的重要作用以及在生命科学研究中的应用进行了归纳总结.     

RNA干扰技术在植物中的应用研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一项新的分子生物学技术,是外源和内源性双链RNA(double-strands RNA,dsRNA)在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象。目前,RNAi及相关沉默反应的机制在植物中的研究取得了重大进展,在此对RNAi在植物功能基因组分析、抗逆性、抗病虫害和农作物遗传改良等方面的研究进行概述,以期为RNAi技术在植物上的深入研究提供参考。     

猪Zfx基因RNAi片段的筛选

为了研究Zfx基因在精子发生过程中的作用,本实验利用RNA干扰技术针对猪Zfx基因m RNA的不同靶位设计构建了4个不同的sh RNA干扰载体:3个RNAi-Ready-p SIREN-Retro Q-Zs Green(p SIREN)质粒重组载体(a、b、c),1个p LL3.7慢病毒骨架质粒重组载体(p LL3.7-sh RNA)。通过对仔猪睾丸体外培养生精细胞中的Zfx基因进行人为干扰后,提取总m RNA,利用q RT-PCR对Zfx基因m RNA表达进行丰度测定。结果表明:p SIREN质粒重组载体干扰组对Zfx基因没有明显地作用,慢病毒骨架质粒重组载体干扰组对Zfx基因表达抑制效果显著,抑制率为51%(P﹤0.05)。结论:筛选获得了慢病毒骨架质粒重组干扰载体,其对仔猪睾丸体外培养生精细胞中的Zfx基因表达具有显著地干扰作用。     

RNA研究的新进展

RNA研究的新成果不断出现和有关RNA操作新技术的应用是进入21世纪以来分子生物学研究的重要突破之一。依据国内外的大量最新资料,主要述评RNA研究中所揭示的新理念、反义RNA技术应用进展、RNA干扰等新突破和新技术的研究进展,包括植物、动物、医学等各个领域的内容。     

玉米陈化关键酶基因Zmlox-2的RNA干扰载体的构建%

脂肪酸氧化酶(LOX)催化不饱和脂肪酸过氧化反应,导致玉米(Zea mays L.)种子储藏品质的下降.为抑制玉米陈化关键酶基因Zmlox-2的表达,依据RNA干扰原理,针对玉米Zmlox-2基因进行克隆,采用重组PCR及酶切连接技术成功构建了Zmlox-2基因的RNA干扰植物表达载体,并将重组载体pRI101-on-Zmlox-2-RNAi通过热激转化法转化到根癌农杆菌中.实验结果表明Zmlox-2基因的RNA干扰表达载体构建正确,这为下一步诱导遗传转化、探索陈化酶基因的干扰表达效果奠定了理论和实验基础.     

RNA干扰及其应用

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA（double—stranded RNA，dsRNA）启动的序列特异的转录后基因沉默过程．在这一过程中，双链RNA被核酸内切酶切割成小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），小干扰RNA与相关的蛋白质结合成RNA诱导沉默复合体（siRNA—induced silencing complex，RISC），RISC识别并降解靶mRNA．现在认为RNA干扰是真核生物共有的抗病毒、抗转座子、抗转基因和抗异常RNA的基因组免疫系统．随着RNA干扰的研究，产生了一种新的技术-RNA干扰技术，并得到了广泛的应用．     

RNA干涉及其在肿瘤研究中的应用

RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默的过程，是一种高效的高特异性抑制基因表达的新途径。通过双链小干涉RNA(siRNA)与一系列蛋白质结合形成siRNA诱导的沉默复合体(RISC)并活化，然后，RISC对靶基因进行识别、降解。与反义方法相比，siRNA具有更好的抑制效果。RNAi的应用将为癌症的基因治疗提供新的方法。     

siRNA分子设计研究进展

为了设计高效的siRNA（Short interfering Ribonucleic Acid）分子、最大限度地减少siRNA分子的脱靶效应（off-target effects），siRNA分子设计已经成为热门研究领域。siRNA分子设计主要是基于序列和能量特征，以及靶标的二级结构特征，基于这些特征设计的siRNA分子已经有了较高的抑制基因表达的效率。RNAi（RNA interference）在
基因发现以及疾病治疗领域已有非常广泛的应用，就siRNA分子设计近年的研究进展作一综述，为今后siRNA研究提供参考。     

siRNA对肺癌细胞株NCI-H460 bcl-2基因表达的影响

目的:研究siRNA (smallinterferenceRNA)对大细胞肺癌细胞株NCI -H4 6 0bcl- 2基因表达的影响。方法:利用Ambion公司提供的设计软件和试剂盒,设计合成以bcl - 2基因为靶标的siRNA ,通过脂质体将合成的siRNA转入NCI-H4 6 0细胞株,设置转染bcl- 2反义药物G3139和空白两对照组。用MTT法检测siRNA对细胞生长的作用;流式细胞仪检测细胞周期的改变和Bcl- 2蛋白表达;RT -PCR检测bcl- 2mRNA水平。结果:siRNA组与对照组细胞存活率均有显著性差异(P <0 0 5 ) ;siRNA组bcl- 2的mRNA明显低于对照组和反义组(P <0 0 5 ) ;siRNA组Bcl- 2蛋白阳性率明显低于对照组和反义组,siRNA组以及反义组细胞阻滞于S期。结论:体外转录合成的siRNA可抑制NCI-H4 6 0细胞bcl- 2基因的表达,抑制率可达5 0 %以上。     

重组腺病毒介导RNA干扰人DLK1基因表达的研究

构建抑制人DLK1基因表达的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术评价其在肝癌细胞株中的基因沉默效应.将针对人DLK1基因的RNAi寡核苷酸序列,连接到腺病毒穿梭质粒中,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183内进行同源重组.重组腺病毒载体在HEK-293细胞中包装扩增,得到高滴度的重组腺病毒.通过绿色荧光蛋白示踪腺病毒的感染效果,并通过荧光实时RT-PCR,western blot的方法证实重组腺病毒能够显著抑制DLK1基因在肝癌细胞株中的表达.     

肌肉抑制素基因与RNA干扰的应用前景

本文综述了肌肉抑制素基因的研究进展,以及RNA干扰技术的功能.展望了RNA干扰技术在肌肉抑制素基因中的应用前景.     

TGFβ1shRNA靶向抑制离体胎鼠肺成纤维细胞TGFfβ1基因表达

目的:探讨自行设计的TGFβ1shRNA对离体胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1基因表达的干扰作用,为研究纤维化病变的基因治疗提供技术基础和依据.方法:原代培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型.针对大鼠TGFβ1基因mRNA序列,设计、合成携带3条TGFβ1shRNA绿色荧光蛋白融合表达质粒载体,并设阴性质粒组和空白组为对照,通过JetPEI包裹分别转染上述高氧损伤的胎鼠肺成纤维细胞.转染后24、48和72 h收集细胞,在荧光显微镜下观察干扰效果,采用实时荧光定量PCR检测TGFβ1基因表达情况,并计算干扰效率.结果:①成功培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型;②荧光显微镜下观察,可见转染后24、48和72 h TG-Fβ1shRNA质粒组细胞绿色荧光强度均明显弱于阴性质粒组细胞,空质粒载体组未产生绿色荧光;荧光定量PCR检测转染后胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1 mRNA表达量,转染后24、48和72 hTGFβ1shRNA质粒组TGFβ1 mRNA表达量均显著低于阴性质粒组(P<0.01),其基因干扰效率则依次递减,分别为97.3%、96.9%和71.7%.结论:本研究证明自行设计的TGFβ1shRNA转染胎鼠肺成纤维细胞后24、48和72 h均能够高效干扰TGFβ1基因的表达,其基因干扰效率呈现一定的时间依赖性.     

RNA interference-mediated inhibition of Hepatitis B Virus replication

Persistent and recurrent infection of hepatitis B virus (HBV) represents one of the most common and severe viral infections of humans, and has caused a formidable health problem in the affected countries. Currently used antiviral drugs have a very limited success on controlling HBV replication and infection. RNA interference (RNAi), a process by which double-stranded RNA (dsRNA) directs sequence-specific degradation of target mRNA in mammalian and plant cells, has recently been used to knockdown gene expression in various species. In this study, we sought to determine whether RNAi-mediated silencing of HBV viral gene expression could lead to the effective inhibition of HBV replication. We first developed RNAi vectors that expressed small interfering RNA (siRNA) and targeted the HBV core or surface gene sequence. Our results demonstrated that these specific siRNAs efficiently reduced the levels of corresponding viral RNAs and proteins, and thus suppressed viral replication. Treatment with siRNA gave the greatest reduction in the levels of HBsAg (92%) and in HBeAg (85%) respectively in the cultured cell medium. Our findings further demonstrated that the RNAi-mediated antiviral effect was sequence-specific and dose-dependent. Therefore, our findings strongly suggest that RNAi-mediated silencing of HBV viral genes could effectively inhibit the replication of HBV, hence RNAi-based strategy should be further explored as a more efficacious antiviral therapy of HBV infection.     

靶向TTF-1的siRNA腺相关病毒载体组装验证

为了解决靶向TTF-1的siRNA导入肺腺癌细胞的问题,设计了3条靶向NCI-H1975细胞TTF-1基因的siRNA,并将其分别构建到腺相关病毒上.在293细胞中装配病毒,收获病毒原初液后进行超滤浓缩、层析柱纯化,测定病毒滴度.重组病毒感染肺腺癌细胞系NCI-H1975,通过Western-Blot实验检测siRNA效果,利用凋亡实验验证细胞生物学效应.Western-Blot实验测得siRNA有较好的干扰效果,凋亡实验测得肺腺癌细胞NCI-H1975产生了凋亡,从而证明具有感染性的靶向TTF-1的siRNA腺相关病毒载体组装成功.     

RNA干涉

RNA干涉是指双链RNA引发的同源mRNA的降解过程,由于其多发生于转录水平,因此又称为转录后基因沉默。RNA干涉现象是在线虫中首次发现的,通过几年的研究发现它广泛存在于生物体中(包括单细胞生物、后生动物和哺乳动物)。本文对RNA干涉现象的发现、作用机制、相关基因等作了简单的论述。     

磷硫代siRNA的抗肿瘤基因沉默活性研究

由于目前尚无高效合成立体特异性磷硫代siRNAs(PS-siRNAs)的化学体系,本研究针对潜在的癌症治疗靶点PLK1,用a-磷硫代三磷酸腺苷(ATPaS)、a-磷硫代三磷酸胞苷(CTPaS)和a-磷硫代三磷酸尿苷(UTPaS)通过T7RNA聚合酶转录合成了部分磷硫代修饰的Rp-磷硫代siRNAs(Rp-PS-siRNAs),探究了nat-siRNAs和PS-siRNAs血清稳定性和基因沉默活性的差异性。发现酶促合成的磷硫代siRNA几乎不影响siRNA的基因沉默效率,但却显著提高siRNA的血清稳定性。因此,酶促转录合成的Rp-PS-siRNA可望作为siRNA的修饰形式,以延长siRNA的生物活性半衰期,使siRNA广泛应用于生物医学临床研究领域。