红冬孢酵母Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成的关键酶.参考已知的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增从红冬孢酵母YM25235中获得了全长为1 341 bp的一个cDNA序列.序列分析表明,该序列具有一个编码446个氨基酸、相对分子质量为50.6 ku的完整开放阅读框,所编码的氨基酸序列与Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶相似性最高但并不相同,而且也具有Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证功能,将该基因序列克隆到表达载体pYES3/CT中,构建重组质粒pY3RKD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSCI中进行异源表达.通过脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,在pY3RKD12转化的酵母细胞总脂肪酸中出现一个保留时间和亚油酸甲酯标准品相同的新峰,其含量占酵母总脂肪酸的3.76%,但在pYES3/CT转化的酵母细胞总脂肪酸中没有检测到.这些结果证明所克隆的序列是一个新的Δ~(12)-脂肪酸脱氢酶基因,其表达的蛋白质可催化油酸合成亚油酸.     

过表达RkHMGCR基因对红冬孢酵母类胡萝卜素合成的影响

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)是甲羟戊酸途径中的限速酶之一,其表达水平和催化活性会影响萜类及其衍生物的合成量.研究从红冬孢酵母YM25235菌株中克隆到一个HMGCR基因,命名为RkHMGCR.序列分析结果显示,RkHMGCR包含一个3 981 bp的开放阅读框,编码1 326个氨基酸,其编码的氨基酸序列与已报道的HMGCR同样具有保守的2个底物结合位点、2个NADP(H)结合位点和与催化活性相关的4个关键氨基酸残基,表明RkHMGCR是一个潜在的新的HMGCR基因.将RkHMGCR转回到YM25235菌株中进行过表达,分析结果显示,基因过表达使YM25235菌株中类胡萝卜素含量提高了42.21%,菌株中油脂和脂肪酸含量分别降低了28.93%和20.31%,这与部分类胡萝卜素合成和脂肪酸代谢相关基因的转录分析结果一致.研究结果可为进一步通过代谢工程手段提高产油红酵母中类胡萝卜素及其特定组分含量的研究提供参考.     

酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶对α-亚麻酸催化活性的研究

多不饱和脂肪酸(po lyunsaturated fatty ac ids,PU FA s)可分为n-6和n-3两个系列,而Δ6-脂肪酸脱氢酶是这些PU FA s合成途径中的限速酶.将少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INV S-cl,在添加外源性底物α-亚麻酸,经半乳糖诱导后,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-M S)联用分析细胞脂肪酸表明,少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,所生成十八碳四烯酸的含量占酵母细胞总脂肪酸的7.67%,而在空载体pYES2.0转化的酵母中没有检测到.同时,参照K ozak序列,我们把少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列进行适当的改变,并转化INV Scl进行分析,结果显示修改后的序列同样能催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,而且表达量提高到细胞总脂肪酸的11.23%,表明在酿酒酵母中,改变转移起始密码子周边序列可提高少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因催化α-亚麻酸转合成十八碳四烯酸的水平.     

mRNA差异显示技术研究低温条件下深黄被孢霉基因的表达差异

mRNA差异显示技术已经广泛应用于研究植物、动物和微生物在各种环境条件下基因的差异表达研究.研究以15℃和30℃培养的深黄被孢霉M6-22菌体为材料,利用mRNA差异显示技术研究两种培养条件下基因的表达差异.经实时荧光定量PCR验证,共获得7条差异片段,相似性搜索结果表明它们是6-磷酸葡萄糖异构酶、单糖核苷酸转运蛋白、Ras1鸟苷酸转移因子、依赖于NAD的苹果酸脱氢酶、Δ12-脂肪酸脱氢酶、CLK4关联的丝氨酸/精氨酸丰富蛋白和假定蛋白,涉及糖酵解、蛋白质修饰、信号传导、脂肪酸合成和mRNA加工等生命过程,表明深黄被孢霉M6-22低温适应性是多种途径协同调控的结果.     

少根根霉△12-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

为探讨采用转基因的方法将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸菌株的可行性,将来自于丝状真菌少根根霉的△12-脂肪酸脱氢酶基因与毕赤酵母的胞内表达载体pPIC3.5K连接构建了重组表达载体pPICRAD12,经Sac I线性化后电击转化毕赤酵母菌株GS115获得转基因酵母菌株PICRAD12.PCR鉴定结果表明,目的基因已经整合到毕赤酵母基因组中.经甲醇诱导表达后,通过气相色谱和气相色谱和质谱连用的方法分析转基因毕赤酵母的脂肪酸成分表明,转基因毕赤酵母的亚油酸含量增加了4.5%,说明了可以通过增加△12-脂肪酸脱氢酶基因的拷贝数或者使用强启动子的方法来增加亚油酸的含量,为将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸的基因工程菌株进行了有意义的探索.     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸延长酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA,C20:4n-6)是合成生物活性物质类二十碳烷酸的初级底物神经组织的重要组成成分.Δ6-脂肪酸延长酶是花生四烯酸Δ6-合成途径的关键酶之一.根据已经报道的Δ6-脂酸延长酶基因序列设计引物,分别从产花生四烯酸的丝状真菌高山被孢霉ATCC16266菌株基因组和cDNA扩增得到该序列.经序列分析后,将来源于cDNA的序列连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K上,得到重组质PIC3.5K-ELO.用电击转化法将重组载体pPIC3.5K-ELO转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,在缺省培养基筛选得到毕赤酵母转化菌株pPIC3.5K-ELO.在适宜的培养条件下,添加外源底物γ-亚麻酸(GLA)和诱导物醇诱导基因表达.气相色谱分析表明该基因在毕赤酵母中得到了表达,底物GLA转化为二高γ-亚麻酸GLA),转化效率为28.91%.对Δ6-脂肪酸延长酶进行跨膜分析,表明该蛋白为具有7个跨膜域的膜结合蛋白.     

毕赤酵母△~9-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。     

磁场对酿酒酵母微观结构及膜脂流动性的影响

以磁场为外加物理场,采用恒定磁场及循环磁处理方式对酿酒酵母进行处理,研究酿酒酵母微观结构及细胞膜流动性的变化.通过透射电子显微镜观察不同磁感应强度恒定磁场处理后酿酒酵母的微观结构.研究发现恒定磁场可以促进酵母细胞的生长,群体中以具有中央大液泡为特征的成熟细胞所占比率增大,同时线粒体呈现适应性膨大、增生.利用原子力显微镜观察循环磁处理下酵母细胞的三维结构,发现细胞壁表面出现皱缩、穿孔,胞质外流.用荧光偏振法对两种处理方式下细胞的膜脂流动性进行测定,发现不同强度恒定磁场处理后,膜脂各向异性下降,流动性增强,0.05T磁感应强度下各向异性值下降3.57%,而循环磁处理后各向异性值比对照提高了8.46%,膜脂流动减慢,证实细胞膜为受到磁场作用的亚细胞结构.     

一种针对马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的无痕基因组改造方法

马克斯克鲁维酵母位于酵母科克鲁维属,具有高分泌能力、高生长速率、多底物利用以及耐高温等特点,具有工业应用前景.因此,建立马克斯克鲁维酵母的基因工程改造技术十分重要.本文以马克斯克鲁维酵母URA3基因缺陷菌株为出发菌株,依据同源重组原理,选用KmURA3作为可循环使用的筛选标签基因,建立了一种针对马克斯克鲁维酵母的无残留多基因敲除技术,以满足其遗传工程改造的需求.本研究利用这种技术成功构建了Kmhis3Δ、Kmura3Δhis3Δ、Kmura3Δade2Δ、Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmhis3Δade2Δ等5株营养缺陷型菌株,为马克斯克鲁维酵母的分子遗传学研究以及工业应用研究提供了遗传材料.     

高等植物脂肪酸去饱和酶及编码基因研究进展

生物膜是细胞、细胞器与外界环境连接的界面,是温度胁迫伤害发生的原初位点。细胞膜脂不饱和脂肪酸含量和组分是影响生物膜相变的主要因素,进而影响植物在温度胁迫下的抗性。脂肪酸去饱和酶是脂肪酸代谢过程中的关键酶,调节细胞膜中脂肪酸的含量和组分。笔者根据脂肪酸去饱和酶在催化反应中的先后顺序将其分为3类,分别阐述这3类脂肪酸去饱和酶与温度胁迫下植物适应性的关系,综述了近年来国内外脂肪酸酶去饱和酶及编码基因的克隆、功能鉴定、表达调控等方面的研究进展,对应用基因工程技术培育出温度抗性较强植物品种的研究进行了展望。     

alg3、vps1301、rad51基因缺失对粟酒裂殖酵母接合生殖的影响

为探寻alg3、vps1301、rad51基因缺失对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)生长及接合生殖的影响,在25 ℃条件下,培养野生型和3种基因缺失的粟酒裂殖酵母,统计并分析其生长情况;将野生型和3种基因缺失菌株分别各自交配产孢,分析对比野生型和基因缺失菌株的接合生殖情况. 结果显示,生长实验中,25 ℃条件下,12 h内,野生型菌株、alg3Δ菌株、vps1301Δ菌株和rad51Δ菌株的平均生长速度分别为0.042 5 、0.009 8 、0.019 3 、0.036 9 OD₅₉₅/h. 结果提示,粟酒裂殖酵母缺失alg3基因后,其生长速度受影响最大.在细胞接合生殖实验中,3种基因缺失菌株产孢数目都出现异常,其中alg3Δ菌株产孢数与野生型表现出显著差异.同时,alg3基因和vps1301基因缺失后孢子长度与野生型存在极显著差异.结果表明,alg3基因缺失对粟酒裂殖酵母的接合生殖影响最大.综上所述,缺失上述3种基因都对粟酒裂殖酵母的生长和接合生殖有不同程度的影响,其中alg3基因缺失对其影响最严重,其次是vps1301基因,rad51基因对其影响最小.     

达乌尔黄鼠白色脂肪组织中多不饱和脂肪酸合成基因表达

多不饱和脂肪酸对哺乳动物细胞膜的结构和功能、免疫能力、脂肪代谢等具有重要的调控作用。为研究其在冬眠动物体内合成受基因表达调控的情况,使用第2代转录组测序技术,对达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricuricus)的白色脂肪组织进行转录组测序,得到羟酰基辅酶A还原酶、烯酰辅酶A脱氢酶、Δ-5去饱和酶和Δ-6去饱和酶的碱基序列,并测得它们在起始育肥期、快速育肥期、育肥完成期和冬眠期4个阶段的差异表达情况。结果显示:羟酰基辅酶A还原酶在冬眠期表达上调,与起始育肥期差异显著;烯酰辅酶A脱氢酶在冬眠期的表达量也显著高于起始育肥期和快速育肥期;Δ-5去饱和酶和Δ-6去饱和酶在起始育肥期高表达。表明达乌尔黄鼠体内多不饱和脂肪酸的合成存在着基因表达的调控,可能以此来实现在不同生理时期对细胞膜流动性和免疫能力的调节。     

Δ^6-脂肪酸脱氢酶的系统进化分析

将已报道的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因所编码的氨基酸序列进行比较,推断它们的系统进化关系.分析结果显示的Δ6-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列都具有3个高度保守的组氨酸富集区,表明它们具有共同起源,并分为原核、动物、高等植物和低等真核4个类型.推测原核类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶是所有Δ6-脂肪酸脱氢酶的共同祖先,真核类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶在后来的进化中形成更具选择优势的细胞色素b5融合蛋白.动物类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶处于真核类Δ6-脂肪酸脱氢酶的最基础分枝,其中鱼类的Δ6-脂肪酸脱氢酶可能是动物类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶通过序列改变向Δ5-脂肪酸脱氢酶进化的中间过度形式.高等植物和真菌类型的Δ6-脂肪酸脱氢酶存在着共同起源,藻类和苔藓可能在高等植物和真菌类Δ6-脂肪酸脱氢酶的进化关系上扮演着重要的角色.线虫的Δ6-脂肪酸脱氢酶作为一个独立而且最基础的分枝位于低等真核单系组中,它可能是一种趋同进化的结果.     

羊肚菌菌株Me11和Me12的培养特性研究

羊肚菌Morchellaesculenta菌株Me1 1和Me1 2的菌丝在PDA培养基、麦芽浸粉培养基和酵母膏培养基上的生长虽然存在差异 ,但长势均良好 ,且均以在酵母膏培养基中长势最好 .在酵母膏培养基上培养时菌株Me1 1和Me1 2在被测的五种温度 4℃、1 0℃、1 7℃、2 5℃和 30℃中 ,以 2 5℃下培养的生长最为良好 .在酵母膏培养基上 ,菌株Me1 2的菌丝体呈褐色 ,菌株Me1 1的菌丝体呈淡色 .羊肚菌菌丝能否形成菌核与培养温度、培养基类型和菌株本身等因素有关 ,菌株Me1 2产生菌核较菌株Me1 1多     

高效除磷菌P7的生长特征及除磷性能研究

目的获取除磷菌纯菌株P7,研究其生长特性和除磷性能.方法从运行良好的生物除磷反应器中分离出一株高效除磷菌株P7,对该菌株进行除磷能力检测、生理生化鉴定、16S rRNA基因比对、生长曲线监测和除磷条件优化等.结果经鉴定菌株P7为假单胞菌,Genbank登记号为KX181642.在不同温度条件下菌株P7均能较好增殖,生长曲线出现了比较明显的迟缓期、对数期,适宜生长温度为25~35℃,最佳生长温度为35℃,当pH为6~8时,菌株P7的生长曲线比较典型,最佳生长pH值为7;菌株P7在不同温度条件下的磷酸盐去除率均在60%以上,最佳除磷温度为30℃,此时磷酸盐去除率达到最大值98.1%,最佳除磷pH值为7.结论菌株P7与其他除磷菌株相比每小时吸磷率最大、最大吸磷量均处于中上水平,除磷能力较高.     

低温胁迫下油菜素内酯对高山离子芥悬浮细胞膜系统的影响

为研究低温胁迫下油菜素内酯(brassinosteroids, BRs)对植物细胞膜系统的影响,使用24-表油菜素内酯(24-epibrassinolide, EBR)在4℃处理高山离子芥(Chorispora bungeana)悬浮细胞.结果显示,低温胁迫下高山离子芥悬浮细胞的离子渗漏率和丙二醛(MDA)含量明显升高,而EBR处理显著降低了细胞的离子渗漏率和MDA含量.此外,低温胁迫下,EBR处理在一定程度上提高了膜脂脂肪酸不饱和程度并明显增强了细胞质膜H~+-ATPase,K~+-ATPase,Ca~(2+)-ATPase以及Mg~(2+)-ATPase的活性.另外,低温诱导CbCOR15基因大量表达.而在低温胁迫初期,EBR处理细胞的CbCOR15基因表达水平更高.以上实验结果表明,EBR在稳定低温胁迫下高山离子芥悬浮细胞膜系统的结构与功能方面发挥积极作用,从而保证细胞生理代谢的正常进行,以提高其抗寒能力.     

生物柴油降凝剂脂肪酸异丙酯的制备及降凝效果的研究

利用脂肪酸与异丙醇在酸催化剂的作用下发生酯化反应来制备脂肪酸异丙酯,研究酯化反应条件如催化剂用量、异丙醇用量、反应时间、反应温度等对脂肪酸异丙酯得率的影响,并通过凝固点的测定来考察脂肪酸异丙脂对生物柴油的降凝效果.正交实验分析得出酯化反应制备脂肪酸异丙脂的最佳反应条件为:催化剂的质量分数为1.5%,异丙醇的质量分数为50%,反应时间为9 h,反应温度85 ℃,降凝实验结果表明把一定量在该条件下制得的脂肪酸异丙酯添加到生物柴油中可有效地降低生物柴油的凝固点,改善其低温流动性能.     

母牛分枝杆菌最佳生长条件的研究

对适宜母牛分枝杆菌 (Mycobacterium vaccae)菌株液体生长的培养基及培养条件进行了研究 ,结果表明在含有 0 .1%的酵母膏培养基中 ,初始 p H7.2 ,培养温度 35℃的条件下有利于母牛分枝杆菌的生长 ,确定为最佳生长条件     

耐冷菌的耐盐驯化与耐冷机制研究

为了改善生物降解法对低温高盐废水的处理效率,于冬季在环境中筛选获取耐低温菌PTJ3-3并通过驯化提高其盐耐受度.通过比较16Sr DNA序列结合Biolog菌种鉴定系统结果鉴定菌种为莓实假单胞菌(Pseudomanas fragi).参考国标法测定PTJ3-3在低温高盐条件下对有机物和总氮的降解效率,48 h其对有机物和总氮的降解率分别为10.34%和14.76%.由于高盐低温条件下微生物对低温的抗逆性与胞内的脂肪酸脱氢酶含量有关,进一步构建了报告基因融合质粒,检测PTJ3-3△-9脂肪酸脱氢酶的启动子强度.研究显示,PTJ3-3菌株△-9脂肪酸脱氢酶启动子序列与对照菌株A000152存在6处碱基差异,PTJ3-3的启动子启动报告基因表达的效率远超过对照菌株.实验结果对冬季高盐污水的生物降解处理具有应用价值,为研究低温微生物的耐冷机理提供了材料.     

酵母细胞膜透性变化对发酵油莎豆粕制乙醇的影响

研究发现,通过在发酵培养基中添加0.8mmol/L棕榈酸可将燃料乙醇产量提高12.7%.生长在培养基中分别添加棕榈酸、亚油酸和不添加任何脂肪酸的菌体经过18%(v/v)乙醇冲击7h,酵母存活率分别为39%、5%和0%.生长于不同脂肪酸条件下酵母的细胞膜富含各自所添加的脂肪酸.菌体生长曲线表明在稳定期,生长于添加棕榈酸条件下的菌体的细胞浓度最大.菌体膜透性由大到小排列顺序为:不添加脂肪酸、添加亚油酸、添加棕榈酸;这与菌体乙醇耐性由弱到强的顺序完全一致,这说明菌体乙醇耐性的提高与细胞膜透性维持较低水平存在密切联系.从乙醇生成动力学模型参数分析可知:随着菌体乙醇耐性的增强,细胞的生长速率和细胞浓度对产物生成速率的贡献也在逐渐加强,这说明在发酵培养基中添加棕榈酸对于缩短发酵周期是有可能的.