藻蓝蛋白裂合酶催化藻红胆素(PEB)与CpcA和PecA共价偶联

 将由鱼腥藻Anabaenasp.PCC7120中cpcE/F构建的pCOLADuet-cpcE/F质粒和pACYCDuet-pebA质粒、pCDFDuet-hol-pebB质粒、pETDuet-pecA质粒、pETDuet-cpcA质粒转化入大肠杆菌,在IPTG的诱导下,实现了色素蛋白PEB-CpcA和PEB-PecA的成功表达.吸收光谱和荧光光谱研究表明,CpcE/F能够催化PEB共价连接到CpcA和PecA的Cys-84上形成色素蛋白PEB-PecA和PEB-CpcA,色素蛋白的最大吸收峰为555nm,最强荧光峰为570nm.Zn²⁺电泳分析结果表明,体内重组获得了目标色素蛋白,证明由cpcE/F所编码的蛋白裂合酶在体内重组中能够催化PEB与CpcA和PecA的共价偶联反应,生成非天然色素蛋白PEB-CpcA和PEB-PecA.     

细菌光敏色素AphA的克隆表达及重组新方法

通过PCR技术，从蓝藻PCC7120中扩增出细菌光敏色素Apha的基因aphA，进而构建aphA的缺失突变体aphA(N-25/C-445)．二者分别转人表达载体pET30a中，在宿主菌中获得高效表达，获得的脱辅基蛋白与CpcA进行体外重组．在本体外重组体系中，以藻蓝蛋白α亚基(CpeA)，在光敏色素自身作用或者藻蓝蛋白裂合酶的帮助下从CpcA上捕获胆色素完成重组．藻蓝蛋白裂合酶CpcE／F能很大程度增强光敏色素脱辅基蛋白从CocA夺取PCB的能力．该结果对于研究细菌光敏色素的色素来源及生理生化机理都具有重要意义．     

藻蓝蛋白裂合酶CpcS1与CpcT1的复合物初步研究

研究证实裂合酶CpcSl、CpcTl能分别催化藻蓝蛋白β亚基(简称CpcB)的两个色素结合位点(84位和155位)共价偶联藻蓝色素PCB(phycocyanobilin),但通过实验发现仅CpcSl和CpcTl共同催化CpcB无法生成天然构像的色素蛋白.为了挑选出辅助裂合酶,经过综合分析,筛选出6个与CpcSl、CpcTl同源的裂合酶.将编码裂合酶的基因按照本实验的需求,重新构建在其它载体上,在大肠杆菌BL21体内表达出蛋白后,分别与CpcSl、CpcTl混合·利用亲和层析分离,然后通过蛋白质电泳图谱初步分析裂合酶之间形成复合物的情况.能形成复合物的裂合酶,再与CpcSl、CpcTl及脱辅基蛋白共同转入大肠杆菌BL21体内进行体内重组研究.结果表明,CpcTl能分别与CpcSl、CpcT2、PecF形成复合物,但这些复合物均不能辅助催化CpcB生成天然产物.     

藻蓝蛋白裂合酶突变体的构建及其对催化功能的影响

在序列分析的基础上，使用PCR技术构建了藻蓝蛋白裂合酶CpcE／CpcF基因的缺失突变体：cpcE（42～276）、cpcE（1～274）、cpcE（1～272）、cpcF（1～160）、cpcF（10～213）．突变体基因克隆至表达载体pET 30a（＋）后，利用体外重组实验对表达蛋白的酶活性进行了研究．揭示了缺失区域在酶催化过程中的作用．     

藻蓝蛋白裂合酶基因的表达与酶活性研究

为了比较研究层理鞭枝藻藻蓝蛋白裂合酶PcE／F与藻红蓝蛋白裂合／异构酶PecE／F的结构与功能,将藻蓝蛋白裂合酶PcE／F氨基酸序列与其他蓝藻的相应序列进行比较,并进行大量表达,将表达的裂合酶PcE／F用于藻蓝胆素(PCB)与藻蓝蛋白α-亚基(α-PC)脱辅基蛋白(PcA)的体外重组,得到天然活性的α-PC,从而表明层理鞭枝藻中pcE／F所编码的蛋白质是α-PC生物合成的裂合酶．     

坛紫菜藻胆蛋白及叶绿素a的测定与分析

研究了不同色泽坛紫菜在不同培养温度条件下含藻胆蛋白及其叶绿素a量的差异,以及样品前处理过程中各因素(研磨、光照、被测定藻体的量等)对测定结果的影响.实验结果表明:1)不同色泽的坛紫菜叶状体在正常培养条件下,含藻胆蛋白和叶绿素a的量各不相同,其中褐红色型藻体的藻胆蛋白和叶绿素a的质量比最高,分别达114.87 mg/g和8.83 mg/g;绿色型藻体的藻胆蛋白的质量比最低(55.39 mg/g);桔红色型藻体的叶绿素a的质量比最低(4.58 mg/g).2)不同温度下培养的坛紫菜,其4种色素的含量存在一定的差异.在本实验条件下,随着培养温度的升高,坛紫菜色素含量也随之增加.3)在影响测定结果的各因素中,对坛紫菜4种色素含量的测定结果影响最大的是研磨,其次为光照.     

海生红藻R-藻红蛋白和隐藻藻蓝蛋白光吸收系数测定

选用Bradford法和Lowry法,以牛血清蛋白和γ-球蛋白作为标准蛋白,分别对从海生红藻异管藻（Heterosiphonia japonica）和多管藻（Polysiphonia urceolata）以及蓝隐藻（Chroomonas placoidea）中分离纯化的异管藻R-藻红蛋白（HR-PE）、多管藻R-藻红蛋白（PR-PE）、蓝隐藻藻蓝蛋白（Cr-PC）进行了蛋白浓度及其特征吸收峰的光吸收系数测定.根据2种方法和2种蛋白针对3种藻胆蛋白的测定结果以及影响结果的主要因素进行了细致地分析和比较,Lowry法是进行藻胆蛋白,尤其是六聚体藻红蛋白浓度及光吸收系数测定的更适合、准确的检测方法;在进行同类或相同藻胆蛋白之间相对含量、比例的定量分析时,Bradford法是一种更便捷的测定方法.由于藻胆蛋白光吸收系数值与选用的蛋白定量检测方法及其所用的标准蛋白直接相关,在使用和比较藻胆蛋白光吸收系数值时必须明确检测方法和标准蛋白,否则藻胆蛋白光吸收系数值将不具有可比性.     

层理鞭枝藻的藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白α—亚基及其色素肽 …

用紫外可见吸收和圆二色光谱研究了层理鞭枝藻的藻蓝蛋白α－亚基色素肽和藻红蓝蛋白α－亚基色素肽的可逆光化学,这些研究表明藻蓝蛋白α－亚基色素钛和菏红蓝蛋白α－亚基色素肽分别相应于藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白的辅基色素结构域,藻蓝蛋白α－亚基色素肽的光谱性质和可逆光化学与藻蓝蛋白α－亚基的相应性质很相似,藻红蓝蛋白α－亚基色素肽的光谱性质和可逆光化学与藻红蓝蛋白α－ 基的相应性质相似,不过藻红蓝蛋白α－亚基色     

藻胆蛋白提取分离及抗氧化活性的测定

藻胆蛋白是一种多功能细胞色素蛋白。从条斑紫菜藻中提取藻胆蛋白,用饱和硫酸铵沉淀法、DEAE-纤维素离子交换层析对提取的藻胆蛋白进行纯化,并首次采用邻苯三酚自氧化法来测定藻胆蛋白的抗氧化活性。从而得出:从红藻中提取分离出具有一定纯度、较高抗氧化活力的藻胆蛋白提取品。     

海生红藻多管藻中藻胆蛋白的分离纯化

选用Middle Fine Sephadex G-150(MFG-150)、Fine Sephadex G-150(FG-150)以及Sephacryl S-300(S-300)3种凝胶过滤对富含R-藻红蛋白(R-PE)的多管藻藻胆蛋白提取液进行R-PE、R-藻蓝蛋白(R-PC)和别藻蓝蛋白(AP)的分离,并对所得R-PE、R-PC/AP组分用DEAE Sepharose-Fast Flow离子交换层析做进一步纯化,优化建立了从多管藻藻胆蛋白提取液中同时有效分离纯化R-PE、R-PC和AP 3类藻胆蛋白组分的技术方法.