树鼩角膜内皮细胞体外原代培养方法的建立

摘要: 目的 建立树鼩角膜内皮细胞( corneal endothelial cells,CECs) 体外分离、培养及纯化的稳定技术,为人类眼科角膜疾病提供新的实验材料。方法 通过比较揭膜法、双酶消化法及揭膜-消化两步法,确定每种树鼩原代 CECs 取材方法的优劣性。分别使用 DMEM /F12,M199,Ham’s F12 /M199 三种培养液以确定树鼩 CECs 原代细胞最适培养液。使用 TGF-β 抑制剂、低血清培养法及梯度消化法来探讨树鼩 CECs 纯化的可行性。苏木精-伊红染色观察细胞形态,根据树鼩神经元烯醇化酶( NES) 设计并筛选特异性引物,使用 PCＲ 方法检测细胞 NES 表达情况并用 NES 抗体进行细胞免疫荧光染色鉴定。结果 揭膜法可以快速、有效得到高纯度的树鼩 CECs 细胞。Ham’s F12 /M199 培养液是树鼩 CECs 的最适培养液。使用 TGF-β 抑制剂可以达到 CECs 的纯化目的。结论 优化的树鼩 CECs 细胞培养纯化方法对树鼩 CECs 的体外培养更适宜,优化条件下分离培养的细胞符合 CECs 的一般特征。     

培养原代小鼠组织细胞检验细胞实验室技术操作规程

目的通过培养小鼠原代组织细胞,检验本科室己建立的一套细胞实验室技术操作规程能否满足细胞培养要求。方法培养小鼠原代成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、肺部细胞、脑部细胞、骨髓间充质细胞和胚胎成纤维细胞。计算原代培养成活率、传代成活率、冷冻及复苏成活率。结果成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、肺部细胞、脑部细胞、骨髓间充质细胞、胚胎成纤维细胞原代培养成活率分别为89%、96%、100%、100%、100%、80%、100%和90%;传代成活率分别为76%、93%、100%、92%、100%、66%、80%和92%;冷冻及复苏成活率分别为100%、100%、100%、100%、100%、100%、100%和100%。结论通过计算KM小鼠8种组织细胞原代培养、传代、冷冻与复苏的成活率,证明现有的细胞室技术操作规程基本上能够保证成功培养出常规原代细胞,并能传代、冷冻和复苏。     

一种简易小鼠原代肝细胞分离方法

对小鼠原代肝细胞分离方法进行改良,通过简单且经济的方法获得小鼠原代肝细胞,采用4.5号输液针经下腔静脉逆行灌流,用长条状纸板对针进行固定,以获取质量稳定的小鼠原代肝细胞悬液.结果显示,改进后的方法灌流成功率高及重现性好并可获得实验所需肝细胞,细胞对台盼蓝拒染率90%.方法操作简单,成本较低且效率较高.     

原代培养对成年小鼠肝组织及肝癌组织理化特性的影响

目的探讨体外培养对成年小鼠肝组织及肝癌组织理化特性的影响。方法采取9月龄H-ras12V转基因雄性小鼠的肝癌组织和癌旁组织及C57/BL6J正常雄性小鼠的正常肝组织进行体外培养,苏木精-伊红染色法检测肝组织在12 d内的生长状态;考马斯亮蓝染色法检测组织中总体蛋白在48 h内的变化趋势;Western blot法检测48 h内培养组织中p-ERK、p-AKT、p-mTOR、GAPDH和Cyclin D1的蛋白表达水平;RT-qPCR法检测48 h内培养组织中18s RNA、Cyclin D1、GAPDH、UQCRB的mRNA表达水平。结果体外培养6 d内,正常雄性小鼠肝组织、H-ras12V转基因雄性小鼠肝癌及癌旁组织的细胞形态变化相似,存活状态良好。体外培养6 d后,正常肝细胞和癌旁细胞逐渐减少,相比之下,肝癌细胞开始出现大量死亡,但出现少数克隆样细胞团。考马斯亮蓝染色检测结果显示,正常肝组织、肝癌组织和癌旁组织的总体蛋白变化趋势相似,随培养时间的延长,在130~170 k D之间的蛋白条带丰度先升高再降低,40~130 k D之间的蛋白条带丰度逐渐增加。Western Blot检测结果显示,随着体外培养时间的延长,组织中p-ERK、p-AKT、p-mTOR、GAPDH和Cyclin D1的蛋白表达水平呈逐渐下降趋势。RT-qPCR检测结果显示,Cyclin D1在正常肝细胞、肝癌细胞及癌旁细胞和GAPDH在正常肝细胞、癌旁细胞中随培养时间的延长,呈现逐级升高趋势;而GAPDH在肝癌细胞和UQCRB在正常肝细胞、肝癌细胞及癌旁细胞中随培养时间的延长,呈现先下降后又逐渐升高的趋势;18s RNA的mRNA表达水平在正常肝细胞、肝癌细胞及癌旁细胞中没有规律性趋势变化。结论成年小鼠肝组织及肝癌组织在体外培养期间,虽然肝细胞的形态学变化不明显,存活良好,但短时间内,众多基因在mRNA和蛋白的表达水平上发生了显著的变化,对实验结果将有较大的影响。     

小鼠肝脏特络细胞的分离与鉴定

[目的]基于已有的特络细胞分离方法,构建一种更为稳定高效的肝脏特络细胞分离方法,为后续特络细胞对肝脏潜在调控作用的研究建立坚固的理论基础和实验支持.[方法]选取C57BL/6雄性野生小鼠;采用酶液多次短期消化及离心法分离肝脏特络细胞,并进行常规细胞培养;采用CD34+Vimentin免疫荧光染色鉴定所得细胞表型.[结果]成功分离了小鼠肝脏特络细胞;小鼠肝脏特络细胞在体外培养时呈CD34及Vimentin双阳性,肝星状细胞系呈CD34阴性及Vimentin阳性.[结论]本分离法可以获得优质的肝脏特络细胞,满足后续研究的需要.     

犬睾丸原发性特有肿瘤的病理学观察与分析

摘要: 目的对三类犬睾丸原发性特有肿瘤进行病理学诊断和分析,探讨犬睾丸原发性肿瘤的病理学特点,为诊断睾丸原发性肿瘤提供资料。方法中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室收集来自动物医院的临床犬睾丸肿物病例,从2013 年至2015 年共35 例,制成切片,HE 染色,根据病理学特征进行诊断与鉴别诊断、比较肿瘤细胞形态特征、根据组织学特点鉴别细胞起源,总结三类肿瘤的病理学特点和鉴别诊断要点。结果观察比较犬精原细胞瘤、支持细胞瘤、间质细胞瘤的组织病理学特征,总结犬睾丸肿瘤的临床特征,为今后该类肿瘤的诊断与鉴别诊断提供有效资料。结论精原细胞瘤、支持细胞瘤和间质细胞瘤为睾丸常见的原发性肿瘤,常见于老年犬,恶性睾丸肿瘤的发病率低。由于肿瘤细胞来源不同,呈现出不同的组织病理学特征。     

人胚肝细胞分离培养研究

目的 探讨体外优化培养人胚肝细胞的方法：方法采用胰蛋白酶和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，胶原酶，胶原酶和pvp消化法分离人胚肝细胞，并比较3种方法对分离人胚肝细胞的效果。结果运用这三种方法均能成功地培养出原代肝细胞，并能够传代；但胶原酶和pvp消化法分离细胞效果最好，细胞贴壁生长能力强。三种消化方法其细胞存活率从高到低依次为胶原酶和pvp消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和pvp消化法。结论人胚肝细胞的分离首选胶原酶和pvp消化法，使用该法在体外培养的人胚肝细胞生长良好，可用于肝细胞移植和生物人工肝等方面的研究。     

IL-2联合银耳多糖激活的同种脾细胞对肝癌实验性治疗的研究

目的研究淋巴因子IL-2联合银耳多糖(Tremella Polysaccharide TP)共同激活的小鼠脾细胞对体外肿瘤细胞的杀伤作用及小鼠移植性肝癌的治疗作用.方法将IL-2激活的小鼠脾细胞(即LAK细胞)和IL-2与银耳多糖协同激活的小鼠脾细胞(即TP-LAK细胞)分别作用于体外培养的3H-TdR标记的肿瘤细胞P815,H22和B16,2h后用γ-闪烁计数仪进行检测,并计算杀伤程度.将上述激活的小鼠脾细胞在小鼠荷肝癌局部皮下注射,隔日1次,共5次.检测肿瘤质量、体积、组织学改变和主要脏器的形态学改变.结果 IL-2与银耳多糖激活的小鼠脾细胞对体外培养的肿瘤细胞有明显的杀伤作用,2种效应细胞对B16杀伤作用最强,H22次之,P815最弱,TP-LAK细胞的作用较之LAK细胞更强,P<0.05.治疗组肝肿瘤质量、体积均低于对照组.组织学上肿瘤坏死程度重且范围广,淋巴细胞、单核细胞浸润明显,纤维组织增生明显.银耳多糖协同IL-2实验组较单纯的IL-2实验组表现得更为明显.除脾脏外,其他主要脏器无明显形态学变化.结论 IL-2激活脾LAK细胞是有效的抗肝癌细胞,IL-2 与银耳多糖在活化脾细胞提高抗肿瘤方面具有协同作用.其对体内主要脏器无明显影响.     

抗人肝癌单克隆抗体JHⅢ的制备及其生物学特性

用肝癌细胞株ＢＥＬ－７４０２脾内直接免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，获得一株分泌肝癌单抗的杂交瘤细胞株ＪＨⅢ，其染色体众数为９０－１１０，单抗ＪＨⅢ系ＩｇＧ２ｂ亚类。杂交瘤细胞培养上清和腹水的效价分别为１：１０＾２～１０＾３和１：１０＾６以上。ＡＢＣ法证实它对肝癌组织有较好的相关性。ＩＦＡ法也证明它对肝癌细胞ＢＥＬ－７４０２有强的阳性反应，而对其他肿瘤细胞株和肿瘤组     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养

目的探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养。方法取BALB/c小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对MEF的生长形态进行观察,并对传代细胞培养液、胚胎胎龄、胰蛋白酶浓度进行筛选。结果 MEF在体外为贴壁生长型细胞,第三、四、五代细胞纯度较高且增殖最为旺盛;添加血清的M199和DMEM均能较好的满足原代细胞的生长,两种培养液中细胞增殖的速度无明显差异;11.5～16.5d胎龄的小鼠胎儿MEF分离效果最好;0.1%胰蛋白酶消化MEF时间以8～11min为宜。结论通过对MEF分离培养影响因素的筛选,为MEF的进一步研究奠定了基础。     

人源性肿瘤异种移植的小鼠模型在肿瘤精准医学中的应用

摘要: 人源性肿瘤异种移植( PDX) 的小鼠模型使用至今已有近半个世纪的历史,是肿瘤学研究领域中的重要工具之一。与传统细胞株荷瘤小鼠模型不同的是,PDX 小鼠模型最大程度上保留了患者体内肿瘤真实的基因组、转录组、蛋白组学以及异常的信号通路特征,被广泛用作肿瘤患者的替代模型进行个性化药物筛选等诸多方面的研究。近年来,随着肿瘤精准医学概念的提出,对PDX 小鼠模型的需求和利用正日益扩大,尤其是借助于PDX 小鼠模型进行肿瘤有效药物的筛选和评估,并逐步将其应用于指导肿瘤患者的个体化治疗,正逐步走向临床。本文就PDX小鼠模型制备的关键因素、临床应用和潜在的不足进行综述。     

不同氧浓度对裸鼹鼠原代鼠星形胶质细胞增殖及生长状态的影响

摘要: 目的建立裸鼹鼠星形胶质细胞体外培养方法,观察不同氧浓度对裸鼹鼠星形胶质细胞增殖及生长状态的影响,寻找最适宜体外裸鼹鼠细胞增殖和生长的氧浓度。方法利用机械法辅以化学法分离新生裸鼹鼠脑内胶质细胞,利用差速贴壁法进行星形胶质细胞纯化,通过设置3%、5%、10%以及20%等不同氧浓度环境,利用CCK8 染色法分析不同氧浓度下裸鼹鼠星形胶质细胞增殖速率,利用免疫细胞化学染色法观察不同氧浓度下裸鼹鼠细胞胞体伸长突起的状况从而进一步判断不同氧浓度下裸鼹鼠星形胶质细胞生长状态。结果利用机械及化学法分离裸鼹鼠胶质细胞并结合差速贴壁法能够成功建立体外裸鼹鼠星形胶质细胞模型。不同氧浓度环境下裸鼹鼠生长速率不同,随着氧浓度的升高,裸鼹鼠进入快速生长期所用的时间越短。氧浓度为20%时,裸鼹鼠星形胶质细胞较小,突起少,状态不佳,但是10%以下的氧浓度环境中,裸鼹鼠能保持较多的细胞突起,状态较好。结论机械及化学法相结合,合并差速贴壁法能够成功建立裸鼹鼠星形胶质细胞体外培养模型, 10% 氧浓度下既可以保证裸鼹鼠星形胶质细胞适宜的生长速率又能保证其处于良好的生长状态。     

人脑膜瘤动物裸鼠移植模型制作方法探讨

摘要: 目的探讨简便易行的人脑膜瘤动物模型制作方法。方法合理控制操作方式,把控实验条件,使用注射器在裸鼠颈背部注射人脑膜瘤组织碎块,绘制肿瘤生长曲线,行病理学检查验证脑膜瘤组织学特征。结果首代移植成功率为78%,传代移植成功率为100%,且首代移植瘤及传代移植瘤均与瘤体来源患者的脑膜瘤组织学类型一致。结论本实验控制条件下的皮下接种脑膜瘤组织块法是制作人脑膜瘤动物模型的理想方法。     

多种沙门氏菌分离培养基效果比较及在实验动物和垫料检测中的应用

摘要: 目的改进实验动物沙门氏菌分离培养方法,建立垫料中沙门氏菌检测方法。方法参考国内外沙门氏菌检测方法,用不同分离培养基对沙门氏菌、大肠杆菌和变形杆菌进行培养。选用最佳筛选效果培养基对动物肠道和垫料样品进行检测。结果BPW 预增菌、MKTTn 选择性增菌转种XLT4 培养基分离沙门氏菌的效果优于其他培养基,在1015 份动物样品中检测出3 份沙门氏菌阳性,能够检测出垫料中1CFU/g 的沙门氏菌。结论改进的沙门氏菌分离培养方法检出率高于现有国标方法,结果准确,可用于实验动物沙门氏菌及垫料的检测。     

桃核承气汤对肝性脑病大鼠肠道菌群的影响分析

摘要: 目的研究桃核承气汤对肝性脑病大鼠肠道菌群是否存在相关的影响。方法本实验对40 只SD 大鼠采用腹腔注射硫代乙酰胺( TAA) 和口腔灌胃该中药方剂汤的方法,观察大鼠的神经HE 分级和血氨的作用,以及对肠道菌群的影响。结果各剂量组不同程度地可降低大鼠HE 级别和血氨的浓度,空肠和回肠的细菌计数与模型组相比呈下降趋势且P ＜ 0. 05,对空回肠菌群具有显著的回调作用。同时各剂量组的双歧杆菌和大肠杆菌也出现回调和B/E 值增高的现象。结论该方剂汤对肝性脑病大鼠的肠道菌群具有正向的影响作用,可增加胃肠道的定植抗力作用。     

小鼠巨细胞病毒PCR 诊断方法的建立及其应用

摘要: 目的建立小鼠巨细胞病毒( MCMV) PCR 检测方法,并进行初步应用。方法根据NCBI 公布的巨细胞病毒设计引物,进行PCR 体系优化、敏感性、特异性测试; 运用优化后的方法,对87 份小鼠血清进行检测,对阳性样本进行测序分析。结果建立的小鼠巨细胞病毒PCR 方法灵敏度高,特异性好,初步检测4 个屏障设施的87 份小鼠血清, 13 份为阳性,通过测序证实为小鼠巨细胞病毒,验证了此方法的可行性。结论为小鼠巨细胞病毒的快速检测提供了方法。     

DAP 玻璃化冷冻液对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的探索和优化小鼠2-细胞胚胎冷冻效果,建立小鼠胚胎冷冻保存技术以及超低温保存模型动物胚胎实验室所需的相关技术。方法选择3 个品系( C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － ) SPF 级4 周龄雌性小鼠,运用超数排卵、体外受精、玻璃化冷冻法,以及二细胞期胚胎复苏、体外培养等技术方法,观察上述实验效果。结果C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － 3 个品系小鼠超数排卵平均值分别为42. 98 个/只、27. 93 个/只、23. 11 个/只,体外受精2-细胞期胚胎率分别为68. 79%、32. 70%、23. 08 %,胚胎冷冻复苏后胚胎回收率72. 77%、80. 87%、83. 33%,存活率分别为56. 92%、54. 84%、70%,存活胚胎体外培养发育到囊胚比率分别为72. 37%、60. 78%、25%。结论选择4 周龄小鼠,按预定相同的技术方法做超数排卵、体外受精、胚胎冻存、胚胎复苏,呈现出较好效果,C57BL/6 小鼠优于基因工程小鼠,基本建立起小鼠2-细胞胚胎冷冻保存技术。     

实验红鲫对137Cs 辐射的氧化应激响应

摘要: 目的探讨实验红鲫对137 Cs 辐射的氧化应激响应和氧化应激生物标记物。方法实验红鲫分别以0 Gy、1. 94 Gy、3. 88 Gy、7. 76 Gy、15. 53 Gy137Cs 辐照,分别于24 h,48 h,72 h,96 h 取出肝脏、性腺,按试剂盒方法检测SOD、GSH-PX 活性,于7 d 和14 d 取出肝脏、肾脏、心脏、脑,按Western blot 方法检测HSP70 含量。结果1. 94 Gy至15. 53 Gy137Cs 辐照能引起实验红鲫氧化应激,SOD、GSH-PX 活性和HSP70 含量发生改变。1. 94 Gy137Cs 辐照诱导实验红鲫肝脏SOD 活性升高, 3. 88 Gy、7. 76 Gy、15. 53 Gy137Cs 辐照诱导实验红鲫肝脏SOD 活性下降,且随辐射剂量升高,其SOD 活性逐渐降低。1. 94 Gy 以上137Cs 辐照诱导实验红鲫性腺SOD 活性下降,并随辐射剂量升高和时间的延长而下降,且下降幅度较大。各辐照处理组实验红鲫肝脏和性腺的GSH-PX 活性变化不大,表现出随辐射剂量升高则活性降低的变化趋势。137Cs 辐照处理后7 d 和14 d,各辐照处理组实验红鲫肝脏、肾脏、心脏和脑的HSP70 表达量均比对照组的高,且随着137Cs 辐照剂量的增加和时间的延长而升高,均存在着一定的“剂量－ 时间－效应”关系。结论实验红鲫性腺对137Cs 辐射的氧化应激响应较敏感,性腺SOD 和肝脏或肾脏的HSP70 可作为氧化应激标志物。