HIV-1逆转录酶非核苷类抑制剂MKC分子结合位点的理论研究

1RT1蛋白是一个HIV-1逆转录酶核心蛋白,是抑制剂药物分子的作用靶点.非核苷类抑制剂MKC分子是1RT1蛋白中的配体分子.采用量子力学密度泛函理论,B3LYP计算方法,结合6-31G(d,P)基组,逐个计算MKC分子与其周围半径0.7 nm结构范围内的34个氨基酸残基相互作用和结合能,发现在1RT1蛋白中103Lys残基是MKC分子的结合作用位点,结合能值为-46.73 kJ·mol-1.该结合位点的发现将为进一步设计和寻找抗HIV-1逆转录酶抑制剂药物分子提供一些理论基础.     

三氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-4(5H)-酮衍生物与二肽基肽酶-4结合机理的理论研究

通过分子对接、分子动力学(MD)模拟和结合自由能分析的方法研究了三氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-4(5H)-酮衍生物药物与二肽基肽酶之间的成键机制,分析和讨论了抑制剂和相邻残基之间的氢键和疏水相互作用.用MM-PBSA方法计算得到的4个抑制剂的结合自由能与实验上测得的结果是一致的.抑制剂与DPP-4的关键残基间的范德华相互作用对于体系的结合能有较大的贡献,并且是区分不同抑制剂生物活性的标志之一.     

自组装法制备丝心蛋白微球

采用自组装法以脱胶天然蚕丝为原料,制备了丝心蛋白微球.对影响微球的成球效果的因素如搅拌速度、乙醇(Et OH)用量、丝心蛋白(SF)浓度和冷冻温度进行了初步探索.结果表明:当V(Et OH)/V(SF)=1︰20,w(SF)=7.0%时,以n=100 r/min的速度进行搅拌,再放入-20℃环境下冷冻24 h最后室温融化,可获得较理想的丝心蛋白微球.     

ERK5对M1型巨噬细胞标志炎症因子iNOS、MCP-1表达的影响

目的:观察ERK5抑制剂XMD8-92对M1型巨噬细胞标志性炎症因子单核细胞趋化因子(MCP-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法:常规培养巨噬细胞RAW264.7,氧化低密度脂蛋白(质量浓度为10μg/mL)和脂多糖(质量浓度为1 ng/mL)建立细胞模型,XMD8-92(浓度为2.5μmol/mL)抑制ERK5表达.实验分为空白、模型和模型+抑制剂组,分别应用RT-qPCR法和蛋白印迹法检测各组细胞MCP-1、iNOS mRNA和蛋白的表达;CCK-8法检测细胞生存率.结果:与正常组相比,模型组MCP-1和iNOS mRNA和蛋白的表达显著升高,有统计学差异(P0.01);与模型组比较,模型+抑制剂组MCP-1和iNOS mRNA和蛋白的表达降低,具有显著统计学差异(P0.01);与空白组相比较,模型组细胞生存率升高,加入XMD8-92后细胞生存率降低,有统计学差异(P0.01).结论:XMD8-92对M1型巨噬细胞的活性有抑制作用,并可抑制MCP-1和iNOS蛋白和mRNA的表达.可能通过抑制ERK5活化,抑制M1型巨噬细胞标志性炎症因子表达,减轻炎症反应.     

Tb~(3+)与磷酸化人中心蛋白1作用的性质研究

通过荧光发射光谱、微量热等温滴定法和荧光共振光散射方法研究了Tb~(3+)与磷酸化人中心蛋白1(phosphorylated human centrin 1,HsCen1p)的作用。结果表明,HsCen1p与Tb~(3+)的结合比为1∶4,与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ位点的结合能力分别为(0.75±0.40)×10~4,(0.70±0.40)×10~4,(8.50±0.40)×10~4和(1.23±0.07)×10~5(mol/L)~(-1),其结合顺序为ⅣⅢⅠⅡ。另外,研究了Tb~(3+)对HsCen1p聚集性质的影响,发现蛋白HsCen1p的N端结构域在聚集过程中发挥重要作用。     

2,3-二芳基-1,3-苯并噁嗪的合成及对利什曼原虫CYP51活性的初步研究

首次对2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1,3-苯并噁嗪(1)与利什曼原虫CYP51的相互作用进行了初步研究,发现化合物1对利什曼原虫CYP51表现出较强的抑制活性,且作用方式类似于底物与利什曼原虫CYP51的I型结合方式.该研究不仅发现了一种新型非唑类针对利什曼原虫CYP51的抑制剂:1,3-苯并噁嗪,而且也为创制新型作用方式的CYP51抑制剂研究提供了依据.     

人类ARF1蛋白的重组表达及其与GDP/ADP的弱相互作用

腺苷酸核糖基化因子1(ADP ribosylation factor 1,ARF1)是一种小G蛋白,负责调控细胞内的囊泡运输,从而影响细胞的生长发育.采用分子克隆的方法构建人类ARF1(hARF1)蛋白的重组质粒pET28a-hARF1,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达纯化,随后利用荧光光谱法和分子对接方法研究hARF1蛋白与嘌呤核苷酸(GDP/ADP)之间的弱相互作用.研究结果表明,重组表达的hARF1蛋白分子质量22 859.29u,与理论值基本一致,其纯度大于95%,产率为5mg/L左右;GDP/ADP与hARF1蛋白弱相互作用的结合常数分别为0.022 69和0.007 71(μmol/L)-1,说明hARF1蛋白选择性地结合GDP,这与细胞内hARF1蛋白只结合GDP的结论一致.     

HIV-1蛋白酶与抑制剂结合中桥接水分子作用的QM/MM研究

对HIV-1蛋白酶与抑制剂2AH和4AH结合的两个复合物体系进行了水溶液环境下量子力学分子力学混合方法(hybrid QM/MM)的1ns分子动力学模拟,用MM-GBSA方法得到桥接水分子W301与HIV-1蛋白酶和抑制剂结合体的结合自由能分别为-24.93 kJ/mol和-20.29 kJ/mol,表明W301在抑制剂和HIV-1蛋白酶结合的过程中起到了不能被忽略的作用。     

HIV辅助受体CCR5常见小分子抑制剂抑制效果的综合评价

通过系统比较CCR5常见小分子抑制剂的抑制效果,寻找CCR5的优化对接靶点,筛选最优抑制剂,为新型抑制剂的研发提供理论依据.基于Material Studio软件,我们构建了7类29种小分子抑制剂的三维结构,全面模拟了各种抑制剂与CCR5对接的效果;利用分子对接绝对自由能、相对自由能、对接姿态百分比和LibDock综合得分等参数评估小分子抑制剂的抑制效果.研究初步发现,CCR5小分子抑制剂的最优对接位点是第二个胞外环与N末端之间的site4.小分子抑制剂的抑制效果由强到弱排序依次为:抑制剂27(吡咯烷类)、抑制剂8(苯并环庚烯类)、抑制剂12(哌啶类)、抑制剂14(螺环二酮哌啶类)、抑制剂21(4-哌啶-1-丁胺类)、抑制剂5(天然小分子类)和抑制剂17(托品烷类);其研究表明,吡咯烷类抑制剂27可能成为CCR5最优抑制剂候选对象.     

4-{6-氨基-2-[(4-氰苯基)氨基]吡啶-4-氧}-3,5-二甲基苯腈盐的合成、结构及生物活性

以2,4,6-三氯嘧啶、3,5-二甲基-4-羟基苯腈、4-氨基苯腈和氨水为原料,经过3步亲核取代反应,得到4-{6-氨基-2-[(4-氰苯基)氨基]吡啶-4-氧}-3,5-二甲基苯腈,2-芳基氨基嘧啶类化合物3.为了进一步研究化合物3的结构及生物活性,将其制备为盐酸盐(化合物4a)和硫酸盐(化合物4b),并经X-射线衍射单晶结构分析,研究了它们的晶体结构.采用荧光素酶法检测化合物抗HIV活性,结果表明该类化合物均表现出抑制HIV-1 SF33病毒株复制的活性.     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

一种云斑天牛气味结合蛋白的分离纯化

为揭示云斑天牛(Batocera lineolata Chevrolat)对气味分子的识别机制,通过荧光结合试验和葡聚糖凝胶G75(Sephadex G75)层析研究了云斑天牛对气味分子的识别情况,并对云斑天牛气味结合蛋白进行了分离纯化。结果表明,云斑天牛气味结合蛋白能与荧光探针N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN)产生荧光结合,云斑天牛触角部位的总蛋白提取液中存在pro. Ⅰ-Ⅻ(Protein Ⅰ-Ⅻ)12种大分子粗提蛋白,这12种大分子粗提蛋白经Sephadex G75纯化后,得到1种能与荧光探针1-NPN产生荧光结合的纯化蛋白pur-pro. I(purified protein I)。纯化蛋白pur-pro. I分子质量约为15.2 ku,对应为大分子粗提蛋白pro. Ⅻ(Protein Ⅻ)。鉴定认为,分离纯化蛋白pur-pro. I是云斑天牛的一种气味结合蛋白。     

基于纳米金表面等离子体共振光散射法测定视黄醇结合蛋白

采用柠檬酸钠还原法制备了粒径约为12nm的纳米金颗粒,并用其标记视黄醇结合蛋白抗体(anti-RBP).在pH=5.29的KH_2PO_4-Na_2HPO_4缓冲溶液中,纳米金标记anti-RBP可与视黄醇结合蛋白(RBP)发生特异性结合使纳米金颗粒凝集成网格结构,由于纳米金颗粒的表面等离子体共振效应,使其在620nm处共振光散射信号显著增强.C_(RBP)在0.1~60ng·mL~(-1)范围内与共振光散射增强值ΔI_(620nm)线性相关,检出限为0.02ng·mL~(-1),用于定量分析人血清中的RBP,方法简单、灵敏,结果满意.     

Wnt/β-连环蛋白通路在免疫检查点抑制剂耐药中作用的研究进展

Wnt/β-连环蛋白信号通路是癌症领域最热门的分子靶点之一,与许多恶性肿瘤的发生和发展密切相关. Wnt/β-连环蛋白信号通路还广泛应用于肿瘤免疫调节,异常活化的Wnt/β-连环蛋白与肿瘤免疫抑制微环境密切相关.目前,免疫检查点抑制剂的研究和应用已相当广泛,但是以靶向程序性死亡受体1 (programmed cell death protein 1, PD-1)/程序性死亡配体1 (programmed cell death ligand 1, PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4)为代表的免疫检查点抑制剂存在患者响应率低和耐药的问题. Wnt/β-连环蛋白的激活会抑制肿瘤微环境CD8⁺T细胞的浸润,抑制抗肿瘤免疫反应并诱导免疫检查点抑制剂耐药.重点讨论了Wnt/β-连环蛋白信号通路与免疫检查点的关系,并对Wnt/β-连环蛋白抑制剂联合免疫检查点抑制剂治疗恶性肿瘤的研究进展进行综述.     

自分泌运动因子(ATX)抑制剂结合位点的预测及其与rPAI-1的分子对接

利用复合物指纹的虚拟筛选预测自分泌运动因子(ATX)抑制剂的结合位点,并通过与24个抑制剂(10个脂质和脂基抑制剂,14个小分子抑制剂)分子对接和动力学模拟表明,Thr209,Asp172,Tyr306,Phe210,Leu243,Leu213和Phe274是抑制剂结合位点的重要残基,且这些残基均通过侧链与抑制剂作用.利用3D-partner预测出与ATX结合的蛋白为纤溶酶原激活物抑制剂1(rPAI-1),并通过同源模拟,得到rPAI-1的分子结构.利用软件GRAMM将ATX与rPAI-1分子结构相结合,并通过分子动力学模拟确定与大分子抑制剂rPAI-1作用的ATX重要残基Glu155和Ala158.     

人类疱疹病毒7 U41蛋白DNA链结合能力分析

目的 :对人类疱疹病毒 7(humanherpesvirus 7,HHV - 7)U4 1的核酸结合能力进行分析鉴定。方法 :DNA结合蛋白分离收集、免疫沉淀及Western印迹检测U4 1蛋白对单、双链DNA的不同结合能力。结果 :U4 1蛋白能结合单链DNA而不能结合双链DNA。结论 :U4 1的功能之一是保持DNA模板的合适构型 ,以便DNA的延伸和病毒DNA的合成。     

孝义河枯、丰水期溶解有机物(DOM)的光谱特征

采用紫外-可见光谱和激发-发射矩阵光谱与平行因子分析相结合的方法，研究了孝义河溶解有机物(DOM)光谱特征和荧光成分的时空变化，分析了DOM与水质参数的关系.结果表明：枯水期发色团溶解有机物(CDOM)浓度、芳香性、分子相对质量和光化学反应活性显著高于丰水期(P<0.01),丰水期的腐殖化程度高于枯水期；模型共检出3种类腐殖质组分(C1,C2和C3)和1种类蛋白组分(C4),枯水期腐殖质成分和类蛋白成分来源于流域点源排放，丰水期蛋白质成分来源于点源，腐殖质成分受点源和面源共同影响；荧光溶解有机物(FDOM)组分与水质参数的相关性和回归分析表明其对关键水质指标(化学需氧量，COD)具有良好的预测能力.因此，DOM的紫外光谱参数和荧光组分可用于快速水质监测和污染源指示.     

分子模拟研究AChE与酮类曼尼希碱衍生物抑制剂相互作用的结合机理

主要通过分子对接(autodock)、分子动力学(MD)模拟和结合自由能(MM/PBSA)计算等方法研究了3种酮类曼尼希碱衍生物抑制剂(下文它们被标记为M1、M2和M3)与AChE的结合模式和相互作用机理.分析表明,结合自由能的计算结果与实验测得的IC_(50)值结果相对应,而范德华相互作用是这3种抑制剂与AChE结合的主要驱动力.其中,M2和M3与AChE的结合模式相似,但与M1相比有些不同,这点在抑制剂与周围残基之间的能量分析上也有所体现.残基W84和E82则是区分抑制剂M1、M2和M3生物活性高低的关键性残基.     

FOXM1688-748结构域相互作用蛋白的鉴定

为了鉴定转录因子FOXM1转录激活结构域(C-端第688位到748位氨基酸序列)的互作蛋白,以FOXM1的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法扩增获得其转录激活结构域序列,克隆进入原核表达载体pGEX-4T2;利用大肠杆菌原核表达获得融合谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)标签的重组蛋白GST-FOXM1688-748;通过GST-pulldown结合质谱方法鉴定FOXM1688-748的互作蛋白,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T2-FOXM1688-748,获得了原核表达的重组蛋白GST-FOXM1688-748.将质谱鉴定获得的互作蛋白进行分析和归类,预示一些互作蛋白可以参与激活FOXM1的转录活性,如RPN2、MISP、MCM7蛋白,一些互作蛋白可以参与调控FOXM1蛋白的稳定性,如USP9Y、CUL4A、HSPB1、BAG2蛋白.FOXM1蛋白的转录激活结构域与许多不同功能的蛋白发生相互作用,暗示该结构域具有重要的分子生物学作用,期望为以FOXM1为靶点的临床药物研发提供实验依据.     

萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

本研究从萨尔瓦多型银合欢(Leucaena leucocephala cv.Salvador)种子中分离纯化出一种新的胰蛋白酶抑制剂,即萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白抑制剂(Trypsin Inhibitor from Leucaena leucocephala cv.Salvador seeds,LlsTI).成熟的种子经粉碎,生理盐水浸提之后,经CM-Sepharose阳离子交换层析得到LlsTI纯品.该胰蛋白抑制剂为19.8kDa的单体蛋白.其N末端测序结果为KGSYLRDVRG,而其内部则含有一段KTAPLVVGFLK的序列,与已知的蛋白酶抑制剂序列都不同,表明LlsTI为一种新的胰蛋白酶抑制剂,同时也含有一部分与已知Kunitz型抑制剂相保守的碱基.LlsTI对胰蛋白酶的摩尔抑制比近似为1∶1.其对于胰蛋白酶属竞争性抑制剂,其Ki值为2.77×10-10 M.LlsTI对胰蛋白酶的抑制活力表现出对高温和pH变化较高的耐受性.但其活性受100mM DTT影响.本研究对LlsTI对其它丝氨酸类蛋白酶的抑制作用也做了测定,其中只有胰蛋白酶的活性受到了抑制.根据圆二色谱的分析结果,LlsTI是一种αβ蛋白,其二级结构在室温下的水和缓冲液Tris-HCl(pH7.5)中组成相似.