利用环介导恒温扩增法简易诊断松萎蔫病

诊断松萎蔫病的传统方法是从木质组织中分离松材线虫,然后用显微镜进行形态学鉴定.基于DNA分子检测的方法尽管很灵敏,不需要固定发育阶段的松材线虫,但是仍然需要用Baermann漏斗法分离线虫,并且需要昂贵的仪器.笔者研发了利用环介导恒温扩增法检测松材线虫的存在,该方法包括:(1)从木块中提取DNA；(2) DNA扩增；(3)通过反应溶液的颜色做出诊断.该方法仅使用培养箱且整个过程只需要90 min,比以往方法更加简便和快速.     

松材线虫实时PCR检测技术

根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F11/R11与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时PCR检测方法.采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测.结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号.表明探针TaqMan-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性.此外,利用检测方法,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005 Pg的松材线虫DNA含量.实时PCR也可以成功地检测出单条松材线虫.     

松材线虫快速检测试剂盒研制

采用引物对K09F2/R对枯死松树内分离的松材线虫、拟松材线虫及其他线虫进行检测,结果表明,所有松材线虫株系均扩增出一条340 bp的清晰、明亮的条带.而拟松材线虫、其他线虫均无扩增产物.利用引物对K09F2/R构建了松材线虫检测试剂盒.采用该试剂盒可使整个检测过程不超过2.5 h;该试剂盒检测灵敏度为1/7 条线虫,达到了对幼虫成功鉴定的目的,且检测结果便于判读,检测费用较低.     

福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析

采用常规检测法(贝尔曼漏斗法)研究了松枯死木中的线虫种类、相互存在关系和检出情况。初步将线虫分为4大类:松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫。其在枯死木中的存在关系有14种类型。(1)松材线虫;(2)松材线虫、拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(3)松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(4)松材线虫和非伞滑刃属线虫;(5)松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(6)松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(7)拟松材线虫;(8)拟松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(9)拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(10)拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(11)伞滑刃属其它线虫;(12)伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(13)非伞滑刃属线虫;(14)无线虫。2008~2010年,松材线虫检出率分别为34.59%、28.21%和24.19%,呈逐年下降趋势;拟松材线虫检出率为14.04%、16.03%和0.8%。每年松材线虫检出率与季节的关系差异不明显,但常年基本上都有松材线虫,为枯死木的取样增加了难度。应用指示剂1号进行快速检测,结果表明,对于松材线虫病木,其准确率达100%。随着时间流失,松材线虫在枯死木中慢慢消失,影响常规检测和快速检测结果,所以尽量在松树枯死初期取样。     

“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定

2006年5月，我校森林资源与环境学院叶建仁教授主持完成的“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。该项研究对松材线虫与拟松材线虫特异片段进行了系统筛选，共获得了7个松材线虫DNA特异片段与5个拟松材线虫DNA特异片段，为松材线虫与拟松材线虫的分子鉴定奠定了基础。首次将2个松材线虫与2个拟松材线虫的DNA特异片段成功转化为SCAR标记，丰富了松材线虫与拟松材线虫分子标记方法。首次采用SCAR标记方法成功构建了松材线虫检测试剂盒，PCR检测过程仅需2．2h。首次成功标记了一个可用于检测松材线虫的非放射性探针DlG—F2／R1。用该探针对线虫基因组DNA点杂交，松材线虫均表现有较强的杂交信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等均无杂交信号。成功设计、合成了TaqMan探针与其配套的引物对F11／R11。     

感染松萎蔫病的葡萄牙海岸松中内生细菌的分离

葡萄牙海岸松被松材线虫感染后的迅速死亡表明有其他生物的介入。内生细菌是一类普遍存在的生物,它在大部分植物中能形成种群。松材线虫携带的细菌也有可能导致海岸松的迅速死亡。笔者通过培养分离得到的细菌分离物,利用扩增性核糖体DNA限制性酶切片段分析(ARDRA)和变性梯度凝胶电泳分析(DGGE),了解被感染的和未被感染的海岸松内生细菌的种群结构,以分析鉴定与松材线虫相关的细菌。从样树和松材线虫中分离的细菌Alphaproteobacteria、 Bacteroidetes 属仅存在于内生菌中,而Actinobacteria、Firmicutes被发现仅与松材线虫相关。 ARDRA和 DGGE 分析证明内生菌种群结构多样性的差异可能与松材线虫的入侵有关。这种细菌种群的多样性差异似乎与Burkholderia、 Pseudomonas 和Luteibacter属中的某些菌株有关。而从树中分离出来的Janthinobacterium agaricidamnosum、 P. lutea 和 Dyella yeojuensis 与松材线虫相关     

松材线虫与拟松材线虫RAPD检测技术

采用RAPD技术对松材线虫和拟松材线虫进行了检测研究,从140个随机引物中筛选出引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18。引物OPK09对12个松材线虫株系扩增出一条约2400bp左右的特异片段,引物组合OPC18 OPN18对10个拟松材线虫株系扩增出一条970bp左右的特异片段。实验表明,引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18具有特异性强、灵敏度高的优点。用这两组引物可以快速、准确鉴定松材线虫和拟松材线虫。     

韩国伞滑刃属线虫的形态和分子特征

以锥尾伞滑刃线虫（Bursaphelenchus conicaudatus）作为对照,在韩国不同地域和寄主中采集了15个松材线虫分离物、3 个拟松材线虫的分离物及5个未鉴定的该属的分离物,并对其进行了ITS 和 D2D3 rDNA序列分析。以单条雌线虫的DNA为模板,ITS 和 D2D3 区由PCR仪扩增并克隆其序列。结果表明,所有松材线虫的ITS 和 D2D3 区序列相同,没有种内变异。然而2个采自黑松和红松的拟松材线虫分离物的基因型分别是亚洲型和欧洲型。5个未鉴定线虫的数据表明,它们分别接近B. tusciae、B. lini、B. thailandae、B. doui和 B. hylobianum,该结果同时被形态学结果所支持。利用5种酶（Hinf I、Alu I、Msp I、Hae III、Rsa）,PCR产物克隆并测序的数据也可以区分不同种和基因型。     

松材线虫病致病机理和防治技术研究进展

在松材线虫病的研究方面,目前比较一致的观点是松材线虫在整个病程中起着重要作用,其中多数学者认为松材线虫是唯一病原,还有认为松材线虫携带的细菌与松材线虫一起导致发病。在致病机理的研究中,有三种主要观点:(1)松材线虫分泌的酶破坏了松树薄壁细胞的壁和膜,导致松树死亡;(2)松材线虫入侵松树后,松树体内出现了导致松树死亡的毒素;(3)松树感染松材线虫后,木质部内挥发性物质增加,管胞中形成了空洞,致使松树体内水分输导受阻,松树萎蔫死亡。在松树对松材线虫的抗性方面,树种之间抗性的差异性较显著,而同种松树不同地理种源之间抗性的差异性的显著程度因树种而异。     

松材线虫和拟松材线虫种间及种内遗传相关性的RAPD分析

运用RAPD技术对来自日本、韩国、美国、加拿大和中国大陆6省及台湾地区的松材线虫和拟松材线虫16个虫株的基因组DNA进行随机扩增,聚类分析结果显示,松材线虫和拟松材线虫明显分为两大类。在松材线虫群体中,又可分为3个亚组:中国大陆虫株与日本虫株为一亚组,加拿大虫株为一亚组,中国台湾虫株与美国虫株为一亚组。拟松材线虫群体亦可分为两亚组:一为日本、中国台湾和中国江苏虫株,二为韩国和中国湖南虫株。