大鼠APKD基因分子克隆研究

以人ＡＰＫＤ基因探针２１８Ｅｐ６在大鼠基因组文库中筛选到阳性克隆ｐＭ１，经充分鉴定证实含有探针的同源顺序。     

大鼠APKD基因的分子克隆研究：Ⅰ.大鼠基因组文库的构建

以质粒ＰＢＲ３２２为载体、ＢａｍＨＩ部分酶切片段（４～１０ｋｂ）为目的片段成功构建了大鼠基因组文库并进行了鉴定，文库总重组子数为３．２×１０７，插入比例９５％，为大鼠ＡＰＫＤ基因的克隆筛选以及有关大鼠基因的其它一些研究奠定了基础．     

斜纹夜蛾NPVp74基因的克隆及部分序列分析

以含ｐ７４基因的ＡｃＮＰＶＥｃｏＲⅠ－Ｐ片段作探针,与ＳｌＮＰＶ基因组在非严格条件下进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,将ＳｌＮＰＶｐ７４基因定位于４９００ｂｐ的ＳｌＮＰＶＸｈｏⅠ－Ｐ片段．对ＳｌＮＰＶＸｈｏⅠ－Ｐ片段中的一段９４０ｂｐ的ＤＮＡ片段进行序列测定,通过ｉｎｔｅｒｎｅｔ经ＢＬＡＳＴ与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中的ｄａｔａｂａｓｅ比较分析发现,序列中的一段２４３ｎｔ序列与ＡｃＮＰＶｐ７４基因有６０％的同源性,一段８１ｎｔ序列与ＡｃＮＰＶｐ７４基因的同源性高达７９％．与ＣｆＮＰＶｐ７４相比,２段２６４ｎｔ和１００ｎｔ序列分别有６０％和７１％的同源性．测得序列中的部分序列与ＢｍＮＰＶ、ＯｐＮＰＶｐ７４基因也有高达５８％～７８％的同源性．同时,这部分序列编码的氨基酸与ＡｃＮＰＶ及ＯｐＮＰＶＰ７４蛋白的氨基酸序列也有很高的同源性．结果表明所测序列的一部分为ＳｌＮＰＶＰ７４蛋白Ｃ－端的编码序列．     

小麦叶绿体psbA基因的克隆及表达

用ＰＣＲ直接从小麦叶绿体基因组扩增到完整的ｐｓｂＡ基因，并构建了ｐｓｂＡ基因的克隆ｐＴＤ１Ⅱ。为研究ｐｓｂＡ基因在Ｅ·ｃｏｌｉ中的表达，将完整的ｐｓｂＡ基因正向插入高表达载体ｐＫＫ２２３－３中构建表达克隆ｐＫＴＤ１。含有重组表达质粒的转化细胞经ＩＰＴＧ诱导后提取总蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，小麦叶绿体ｐｓｂＡ基因能在Ｅ·ｃｏｌｉ中表达３２ｋＤ的Ｄ１蛋白，表达的Ｄ１蛋白占细菌总蛋白的３％以上。     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

大肠杆菌基因启动子探针型载体的构建

利用ＰＣＲ技术将ｐＵＣ１８和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中的多克隆位点区（ＭＣＳ）及旁侧序列分别进行扩增,然后将扩增产物插入到已除去ＬａｃＺα基因的ｐＵＣ１８中,获得三个中间载体ｐＳＵＧＶ１,ｐＳＧＶ２和ｐＳＵＧＶ３,最后将ｐＳＵＰＶ２中无表达活性的新霉素磷酸转移酶Ⅰ（ＮＰＴⅠ）基因分别插入到三个中间载体的ＭＣＳ中,构建成功大肠肝菌基因启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ４,ｐＳＵＰＶ５和ｐＳＵＰＶ６．     

枯草杆菌强基因启动子DNA片段的序列分析

对利用基因启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ２,从枯草杆菌ＡＳ１．３９８中克隆３个稳定的具有强启动功能的ＤＮＡ片段,进行限制酶切分析发现,ｐＢＳＵ２２和ｐＢＳＵ４３中的插入片段小于０．２ｋｂ,ｐＢＳＵ４４中的插入片段为３ｋｂ。测定结果表明,３个插入片段中都有较为典型的原核生物基因启动子序列,其中ｐＢＳＵ２２和ｐＢＳＵ４３的插入序列几乎完全相同。２     

致弱I型MDV pp38基因同源物的克隆和序列分析

将致弱Ｉ型马立克病病毒（ＭＤＶ）感染的细胞基因组ＤＮＡ的ＥｃｏＲＩ酶切产物建于ｐＵＣ１８质粒载体文库中,以ｄｉｇｏｘｉｎｇｅｎｉｎ标记的含有中毒ＧＡ株ＭＤＶｐｐ３８基因克隆片段作为探针,进行了原位杂交反应,初步筛选出阳性重组质粒,进一步用ＥｃＲＩ酶切分析筛选到含ｐｐ３８基因同源物的重组ｐＵＣ１８质粒,序列人析表明该ｐｐ３８基因同源物与ｐｐ３８基因有极高的同源性,仅有１个碱基突变并导致１个氨基酸的夫     

在大肠杆菌中克隆类产碱假单胞菌基因启动子

类产碱假单胞菌 (Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ)是 1991年从重庆歌乐山林场自然病死的黄脊竹蝗(Ｃｅｒａｃｒｉｓｋｉａｎｇｓｕ)中分离到的一种新的病原菌 ,对多种草地蝗虫有较强的感染力[1] .近年来对其杀虫致死机理、杀虫蛋白[2 ] 、安全性[3 ] 等方面进行了深入研究 ,证明该菌对蝗虫致病是由于其代谢产生的一种杀虫蛋白所致 .该蛋白分子量为 2 5 10 0Ｄａ ,经研究表明 ,该菌无芽孢 ,本身具有较强的毒蛋白 ,故具有构建成为基因工程菌广泛用于生物防治的潜力 .我们采用启动子探针型载体 ｐＳＵＰＶ4 ,分离Ｐ…     

SpltNPVp49基因的克隆和序列分析

根据新发现的杆状病毒凋亡抑制基因ｐ４９基因的序列设计了一对引物,以ＳｐｌｔＮＰＶ基因组ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ扩增获得了预期大小的约１．３ｋｂ的ＤＮＡ片段,将此片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上并直接测序。序列分析表明,该片段为ＳｐｌｔＮＰＶ完整的ｐ４９基因开放读码框。与已知的杆状病毒ｐ４９基因的序列同源性为８７％,与之对应的氨基酸序列的同源性高达９３％。它是首次从ＳｐｌｔＮＰＶ中克隆到的抑制细胞凋亡的     

SlNPV p10基因特征的研究

从病毒感染后期的斜纹夜蛾幼虫脂肪体中提取ｍＲＮＡ,反转录合成ｃＤＮＡ探针,并使之与ＳｌＮＰＶ基因组的酶切片段杂交,将ＳｌＮＰＶｐ１０基因定位于ＢａｍＨ Ｉ－３．０千碱基片段上。ＳｌＮＰＶｐ１０是目前发现的最长ｐ１０基因;基因的启动子内含有２个ＡＴＴＧＴＡ基序,是目前所发现的ｐ１０基因中唯一含有２个Ａ／ＴＴＴＧＴＡ基序者。ＳｌＮＰＶ Ｐ１０蛋白含有１０个七肽重复单元,可形成１个相对较长的卷曲螺旋。Ｓ     

凤尾菇线粒体DNA片段的克隆与同源性分析

将Ｓａｕ３ＡＩ部分酶切的凤尾菇线粒体ＤＮＡ插入质粒载体的ｐＢＳ＾＋的ＢａｍＨＩ位点，然后以凤尾基线粒体ＤＮＡ为探针与重组质粒ＤＮＡ进行斑点杂交，筛选到６个阳性克隆，选取其中２个阳性克隆的插入片段分别与来６个属的１３个食用菌品种的线粒体ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，其结果显示两探针能与所有测定的侧耳属品种的线粒体ＤＮＡ杂交，并具多态性，但与其它属线粒体ＤＮＡ只有不同程度的杂交，两探针中Ｈ４的杂交范     

紫云英根瘤菌结瘤基因调控片段克隆和分析

通过对紫云英根瘤菌７６５３Ｒ及其Ｎｏｄ－突变株７６５３Ｒ－１侵染根毛试验证实,７６５３Ｒ菌株３１８×１０３ｂｐ大质粒决定早期结瘤功能,分子杂交结果显示,其ｎｏｄＤＡＢＣ定位于该质粒上．将７６５３Ｒ菌株的大质粒ＤＮＡ进行酶切并克隆到表达载体ｐＭＰ２２０上,构建ｌａｃＺ重组子文库,将ｌａｃＺ重组子文库导入７６５３Ｒ菌株,在加有Ｘ－ｇａｌ和种子浸提物的根瘤菌培养基上选择蓝色菌落．通过Ｍｉｌｅｒ试验测定它们的β－半乳糖苷酶活性,获得１株种子浸提物对其有诱导效应的菌株ＨＮ１８,对该菌株所含的重组质粒ｐＨＮ１８进行ｎｏｄＤＡＢＣ探针杂交,发现有１条１．７×１０３ｂｐ的阳性杂交带,说明在ｐＨＮ１８中克隆有结瘤基因启动子     

大肠杆菌（Escherichia coli）甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆

用聚合酶链式反应扩增了大肠杆甜菜碱醛脱氢酶基因，插入ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的Ｘｂａｌ和ＫｐｎＩ位点后转化大肠杆菌，得到了克隆，并亚克隆在植物双元表达盒式载体ｐＧＡ６４３中，通过ＰＣＲ得到证实。     

牛酪蛋白cDNA基因克隆的改建

牛酪蛋白全长ｃＤＮＡ克隆ｐＢａＳ１ｃ１８４Ｘ ＧＬⅢ和ＣＯｒＩ双酶切，回收基中的酪蛋白基因编码片段，与经ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ双酶切的植物表达载体ｐＢＩ１２．１２分两步连接；第一步载体的ＢａｍＨＩ末端与酪蛋白基因的ＢｇｌⅡ粘性末端连接；第二步用Ｔ４ＤＮＡ多聚酶补平酪蛋白基因的ＥｃｏＴＲⅠ末端，再与载体ＳｍａⅠ进行平末端连接而环化。     

用PCR扩增和克隆鸡贫血病毒衣壳蛋白VP2基因

接种鸡贫血病毒（ＣＡＶ）Ｃｕｘ－１毒株于ＭＤＣＣ－ＲＰ１细胞中,并用经狄高辛标记的ＣＡＶ衣壳蛋白ＶＰ１基因克隆ＤＮＡ作为探针在斑点杂交中检测和比较了各代细胞中ＣＡＶ ＤＮＡ水平。通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从ＣＡＶ ＤＮＡ水平较高的ＭＤＣＣ－ＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中扩增出ＣＡＶ衣壳蛋白ＶＰ２基因片段约６５０ｂｐ的编码序列,将该ＰＣＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎＩ位点克隆到ｐＵＣ１９质粒载体中,     

地中海伞藻叶绿体生物节律基因的分子克隆及限制酶图谱分析

本用分离纯化的地中海伞藻叶绿体ＤＮＡ，以ｐｃｏｓ２ ＥＭＢＬ为载体构建了ｃｏｓｍｉｄ分子克隆库。并用果蝇的与生物节律控制相关的ＤＮＡ顺序为探针，从地中海伞藻叶绿体ｃｏｓｍｉｄ分子克隆库中筛选到一组含有同源顺序的克隆，经印迹杂交和限制酶分析，这些克隆都含有与果蝇生物节律探针强烈同ＤＮＡ顺序，且各克隆的限制酶图谱都相互重叠。这一结果表明，在地中海伞藻叶绿体基因组中可能也存在与果蝇相同或基本相同的与生     

克隆蓝藻Calothrix sp.PCC7601 cpcB2A2基因的初步研究

从蓝藻Ｃａｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．ＰＣＣ７６０１染色体ＤＮＡ中分离出含藻蓝蛋白基因ｃｐｃＢ２Ａ２的略３．８ＫｂＤＮＡ片段，与质粒ｐＵＣ１８重组，构建成一种重组质粒，ｐＰＣ２１８－ＰＣＺ，转化Ｅ．ｃｏｄｉＪＭ１０９，获得了一系列克隆子，经斑点分子杂交和限制性内切核酸酶分析，筛选出了初步认为含有ｃｐｃＢ２Ａ２基因的克隆子。     

抗菌肽A-蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与初步分泌表达

采用 Ｅｃｏ Ｒ Ⅰ和 Ｂａｍ Ｈ Ⅰ接头将化学合成的大小为４５ 对碱基的 Ｃ Ａ（１ － ７） Ｍ（５ － １２） 杂合肽基因克隆到 Ｅ．ｃｏｌｉ 分泌表达载体ｐ Ｉ Ｎ－ Ⅲ· Ｏｍｐ Ａ２ 上的 Ｅｃｏ ＲⅠ－ Ｂａｍ ＨⅠ位点之间,并对其在 Ｌｐｐ启动子和 Ｌａｃ 启动子／ 操纵子调控下的分泌表达进行初步研究重组子的地高辛（ Ｄｉｇ） 核酸探针杂交和酶切分析结果表明杂合肽基因克隆成功;抑菌活性的检测结果表明杂合肽基因表达产物有一定的抑菌活性     

牛酪白基因导入大豆的研究

将带有牛酷蛋白基因ｃａｓｅｉｎＢ的植物表达载体ｐＡＳ－２,在大豆自花授粉后,用注射法导入大豆受精子房中。以质粒ｐＡＳ－２的３５Ｓ－Cａｓｅｉｎ-Ｇｕｓ扯段为模板,随机引物法标记探针,对１０３株受体植株后代的ＤＮＡ进行点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,发现其中１株在点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交中均呈阳性。证明外源基因已整合到大豆基因组中。