猪IFNα在毕赤酵母中分泌表达条件的优化及高密度发酵

从发酵时间、接种量、pH值、诱导剂量等方面对重组基因工程（毕赤酵母甲醇利用缓慢型）的摇瓶发酵条件进行了优化，进一步探索了酵母菌表达猪IFNα的发酵工艺，包括种细胞密度对初始发酵期的影响，补加甘油、甲醇速率条件的控制等．结果表明，摇瓶发酵时，诱导最佳时间为96h，甲醇最适浓度为8g/L，发酵pH范围为6.4～9．0．最适接种量2：1．在分批发酵、接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为5～6时，最有利于细胞的高密度培养，在补料发酵时，根据溶氧控制甘油流加速率与时机，细胞干重达到118．75g／L，在48h重组猪IFNα表达量达到1。304g／L．     

鲨鱼软骨活性段蛋白在大肠杆菌中的融合表达及培养条件的优化

采用三角摇瓶来摸索菌种BL21（DE3）/pET3C-aSCAIF表达目的蛋白的最优发酵条件,并在此基础上在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中,利用补料分批培养技术,流加甘油,进行发酵培养.摇瓶培养最优条件：2%接种量、25 mL LB培养基、37℃培养、0.5%的甘油做碳源,接种后4 h加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导4 h后目的蛋白表达量最高.菌种在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中的条件为：以10%的接种量接种到2.5 L发酵培养基中,设定溶氧30%,pH7.0,温度37℃,通气量3 L/min,流加甘油15 g,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导4 h后终止发酵,发酵罐中获得的菌体量为62.1 g.     

重组人生长激素在毕赤酵母中的表达研究

通过单因素分析和正交实验法优化高密度发酵培养基和诱导条件,根据优化结果指导发酵罐发酵.得到改良BSM培养基的最佳配比为甘油30g/L、酵母粉14g/L、K2SO4 13g/L、MgSO4·7H2O 11g/L、CaSO4 0.3g/L、PTM1 4.4mL、0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.5);得到摇瓶培养最佳诱导条件为种龄24h,诱导时间30h,甲醇浓度2%,pH6.3～6.9.瑞士Bioengineering公司L1523型发酵罐发酵结果显示,细胞光密度(OD600)达到294,rHGH表达量最高达到0.54g/L.     

重组胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达及培养条件的优化

采用三角摇瓶来摸索BL21(DE3)/pET28A-Tα1菌种表达目的蛋白的最优发酵条件,并在此基础上在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中,利用补料分批培养技术,流加甘油,进行发酵培养;利用Western blotting进行发酵产物鉴定. 摇瓶培养最优条件:10%接种量、25 mL LB培养基、37 ℃培养, 0.02 g/mL的甘油做碳源,接种后4 h加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导3h后目的蛋白表达量最高. BL21(DE3)/pET28A-Tα1菌种在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到3L发酵培养基中,设定溶氧40%,pH7.0,温度37 ℃,通气量3 L/min,快速流加甘油60 g ,培养4 h后,加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导3 h后终止发酵. 发酵罐中获得的菌体量为36 g/L,蛋白表达率为10%左右.     

溶氧反馈-分批补料高密度培养枯草杆菌谷氨酰胺合成酶工程菌

为了建立枯草杆菌谷氨酰胺合成酶基因重组工程菌BL21/pET28b-glnA的高密度培养工艺,首先以摇瓶培养为基础,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、pH值、诱导剂浓度及时间等进行优化,再扩大至BIOTECH-SBG(5 L)自动玻璃发酵罐培养,利用溶氧反馈补料策略进行分批补料,并在培养过程中保持20%～50%的溶解氧,7.0～7.5的pH,以及1.0g/L乳糖诱导12 h,成功地进行了工程菌的高密度培养,最终细菌干重达到48.1 g/L,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的55%,粗提物酶比活为10.35 U/mg,整个补料过程细菌比生长率稳定的控制在0.1 h-1左右.     

产菊酯降解酶重组菌的高密度发酵工艺优化

为提高菊酯降解酶的产量,利用单因素和正交实验法对重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-sys410的发酵培养基组成和发酵条件进行优化。结果显示最优培养基含有20.0 g·L-1甘油、20.0 g·L-1酵母粉、8.0 g·L-1硫酸铵、100.0 mmol·L-1磷酸盐、5.0 mmol·L-1硫酸镁,以及1.5 m L·L-1的微量元素;发酵条件为装液量50 m L/250 m L、初始培养基pH 7.0、接种量2%,接种培养8 h后乳糖诱导6 h。在7.5 L发酵罐上,使用低浓度碳氮源进行培养,前期恒速补料,对数中后期进行乳糖诱导,后期恒溶氧补料,最终菌体密度和酶活力分别为142.6和3 105.1 U·m L-1,较摇瓶发酵分别提高13.7倍和31.9倍。发酵液经破碎和冷冻干燥后酶活力达到119 426.9 U·g-1,且该酶对菊酯的降解率高于95%。     

全细胞催化甘油生物合成L-果糖体系的构建

L-果糖是一种重要的稀少糖,广泛应用于食品、医药和化学合成等领域。通过构建E型马肝乙醇脱氢酶和NADH氧化酶重组大肠杆菌,再偶联醛缩酶重组大肠杆菌催化甘油合成L-果糖。对表达E型马肝乙醇脱氢酶和NADH氧化酶的菌株进行诱导条件的优化,诱导温度20℃,诱导时间16h,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷添加浓度0.05mmol/L。通过单因素实验研究温度、pH值、湿细胞量、甘油浓度对合成L-果糖的影响,利用正交试验进行优化,优化条件为:温度40℃,pH值为9.0,湿细胞质量浓度为25g/L,甘油浓度为500mmol/L。在优化条件下得到L-果糖2.67g/L。采用全细胞转化方法以廉价的甘油为原料生产L-果糖,不仅省去了繁琐的酶纯化步骤,无须添加辅因子,而且生产成本低廉,期望为L-果糖产品绿色生产及现有技术改造提供理论参考。     

培养条件对重组毕赤酵母高密度表达猪胰岛素前体的影响

研究了基因工程菌P ich ia p astotis高密度、高表达的培养条件。在全合成摇瓶培养基的基础上,考察了诱导过程中甲醇浓度、温度、pH、(NH4)2SO4及磷酸盐浓度等因素对猪胰岛素前体(P IP)表达的影响。研究表明:甲醇的最佳诱导浓度为6 g/L,过高或过低的甲醇浓度都不利于菌体生长和蛋白表达;在菌体生长和蛋白表达阶段,pH应分别控制在5.5和4.0;诱导阶段,培养温度下降到28°C,可以提高重组蛋白质的表达量。上述结果用于15 L全自动发酵罐实验,P IP表达水平达到了1.69 g/L,是摇瓶结果的17倍。     

重组毕赤酵母发酵甘油制备α-葡聚糖酶的研究

【目的】考察甘油对组成型毕赤酵母（Pichiapastoris ）生长和α-葡聚糖酶表达量的影响。【方法】采用单因素实验法考察初始发酵培养基中甘油浓度、补料阶段甘油残留和通气量等对α-葡聚糖酶表达量的影响。【结果】发酵培养基中初始甘油浓度从50 g／L提高到150 g／L,菌体生长和α-葡聚糖酶表达量均未受到影响,继续提高到200 g／L时,α-葡聚糖酶表达量明显下降。补料过程甘油残留在0～5 g／L,菌体生长和α-葡聚糖酶表达量最佳,当甘油残留较多时,菌体生长和α-葡聚糖酶的表达量均受到影响。提高通气量有利于增加α-葡聚糖酶的表达量,发酵78 h为宜,在此条件下α-葡聚糖酶酶活力达1763 U。【结论】该工艺优化了以甘油作为碳源制备α-葡聚糖酶的发酵条件,提高了α-葡聚糖酶酶活力,为大规模生产α-葡聚糖酶奠定了基础。     

毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白高密度培养条件的研究

研究了毕赤酵母基因工程菌高密度培养条件。在全合成培养基的基础上考察了诱导过程中添加(NH₄)₂SO₄、微量元素PTM₁、油酸、甲醇加量及pH等因素对重组人血清白蛋白表达的影响，发现PTM₁能显著提高白蛋白的表达，6mL/L时蛋白表达量最大。诱导期硫酸铵浓度维持在 3g/L左右蛋白表达量最大，高于3g/L抑制蛋白表达。酸性环境不利于蛋白表达，诱导过程维持pH6.0～6.5最佳。甲醇最佳诱导浓度为10mL/L。添加0.05%的油酸可有效提高蛋白表达。可以此作为发酵罐上发酵培养流加成分的参考。     

表达牛肉风味强化肽P.postoris GS115(pGAP9-16BMP)摇瓶发酵条件的优化

从碳源种类及质量浓度、氮源质量浓度、温度、pH等方面对构建的工程菌P.postoris GS115(pGAP9-16BMP)摇瓶发酵条件进行了优化.结果表明,最佳表达条件为:甘油30 g/L,蛋白胨40 g/L,酵母粉20 g/L,挡板三角瓶装液量为30%,菌体生长阶段控制温度32℃,初始pH 6.0,培养96 h.在此条件下,牛肉风味强化肽BMP(Beefy Meaty Peptide)表达量最高为41.9 mg/L.     

利用溶氧作为控制信号补料分批培养生产PHA的研究

利用已构建的工程菌Escherchia coli XL1-Blue(pKSABC),在20L自动发酵罐里进行补料分批培养。研究表明,底物浓度、温度、pH、DO等参数是影响菌体生长和PHA积累的重要因素;通过补料分批培养可以提高PHA的积累量。通过对DO在发酵过程中的变化规律的分析,确定DO作为补料时间的在线控制信号。补料的原则是,使发酵前期菌体大量生长,发酵后期PHA大量积累。在优化条件下,对工程菌Escherchia coliXL1-Blue(pKSABC)进行了60 h的补料分批培养,菌体浓度、PHA浓度和PHA占细胞干重的百分比分别为179g/L,132g/L,73.7%。     

重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素α2b

通过培养重组大肠杆菌BL21(pBAI)表达人干扰素α2b(Human Interferon α2b,hIFNα2b).hIFNα2b表达由PL,启动子控制,通过升温至42℃诱导表达.本研究比较了分批培养和多种补料分批培养方式下hIFNα2b的生产,其中通过恒速流加葡萄糖,hIFNα2b的表达量达到6 540 mg/L,平均生产速率和比速率分别为546 mg/(L·h)和27 mg/(g·h).升温前1.5 h补充25 g酵母提取物,并以0.27 g/(g·h)的比速率供应葡萄糖,hIFNα2b的平均生产速率达到1 006 mg/(L·h),比生产速率为54 mg/(g·h),对有机氮源的得率提高到138 mg/g.     

基因重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子的发酵条件优化

采用三角摇瓶来优化基因工程菌表达重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子(SCAIF)的最佳发酵条件,并以此为基础在Biotop CF-10L自动控制发酵罐进行发酵培养.基因工程菌BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)诱导表达SCAIF蛋白的最佳摇瓶培养条件是:接种量为2%、装液量为75 mL/500 mL、加入IPTG的诱导时间为培养2 h后、IPTG浓度为0.25 mmol/L、诱导时间为2 h.BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)菌种在Biotop CF-10L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到10 L发酵培养基中,设定pH 7.0,温度37℃,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导2 h后终止发酵.发酵罐中获得的菌体量为10.2 g/L,蛋白表达率为25%左右.     

优化甲硫氨酸补料策略提高重组毕赤酵母G12-CBS合成S-腺苷甲硫氨酸

重组毕赤酵母G12-CBS经代谢工程改造,可高效表达重组S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶,并弱化了SAM转化途径的关键酶β-胱硫醚合成酶,是一株优良的SAM高产菌。为了利用G12-CBS高效合成SAM,需对前体(甲硫氨酸)的补料策略进行优化。首先在摇瓶中考察了不同甲硫氨酸(L-Methionine,L-Met)添加量对于G12-CBS的影响,发现每24hL-Met补加量超过3mg/mL时,会影响重组菌生长和SAM合成。在15L发酵罐中优化L-Met的补料速率,当外源补料速率为0.4g/(L·h)时SAM产量最高,分别比补料速率为0.2g/(L·h)和0.6g/(L·h)时提高22.2%和31.8%,达到13.01g/L,比出发菌最高产量提高54%。代谢物及酶活测定的结果表明,较低的L-Met补料速率(0.2g/(L·h))导致前体供应不足而影响SAM合成,过高的补料速率(0.6g/(L·h))可能会抑制三羧酸循环,并且影响氮源的摄取和利用,从而导致菌体生长和产物合成受到抑制。     

利迪链霉菌A02产纳他霉素补料分批发酵参数的优化

 为建立利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02 生产纳他霉素的高产发酵工艺,对其补料分批发酵的主要参数进行了优化。利用pH 值实时监控自动补料摇床辅助优化,筛选出利迪链霉菌A02 产纳他霉素的适宜pH 值范围,以此为控制点进行30 L自动发酵罐补料分批发酵实验,通过分析软件发酵之星（Biostar）5.0 检测分析主要发酵参数动态趋势曲线与纳他霉素产量的相关性。结果显示,菌株A02 最适于纳他霉素生物合成的发酵过程多参数优化组合为：培养温度30℃,pH 值控制在6.25~6.29 范围内,溶氧（DO）为20%~30%,摄氧率（OUR）和CO₂释放率（CER）分别为25~15 mmol/（L·h）和20~12 mmol/（L·h）,氨基氮含量0.20~0.23 g/L,还原糖保持1.5%左右,至88 h 后自然下降,至112 h 为0.32%;此时纳他霉素质量浓度达最高值,发酵上清液中为2.02 g/L,发酵液中为6.98 g/L,较不控制pH 值的对照分别提高28.66%和69.83%,为较好的发酵终点。通过优化调控主要发酵参数有效提高了利迪链霉菌A02 生产纳他霉素的发酵水平。     

突变芳香基硫酸酯酶H260L工程菌的发酵条件优化

通过摇瓶培养对突变芳香基硫酸酯酶H260L工程菌的发酵条件进行初步优化,研究不同发酵条件包括接种量、诱导时期、诱导剂浓度、发酵时间、诱导剂加入方式、发酵温度及培养基初始pH值对重组芳香基硫酸酯酶表达的影响。结果表明,重组芳香基硫酸酯酶工程菌发酵的乳糖诱导表达优化条件为:以5%接种量培养3 h后,加入乳糖诱导剂至5 g/L,诱导表达7 h;当发酵温度为25℃、培养基的初始pH值为7.5时,重组芳香基硫酸酯酶活性最高。在优化条件下,工程菌芳香基硫酸酯酶活性达到2.63 U/m L,是未优化酶活性的46.9倍。突变酶H260L对龙须菜粗多糖硫酸基团的脱硫率为82.1%。     

微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化

对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21（DE3）进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和SDS-PAGE电泳分析.结果表明：谷氨酰胺转胺酶在28℃,添加乳糖为1.2g/L诱导18 h,pH为7.0,培养11.5 h时升温至50℃诱导1 h,再放至28℃培养,表达效果较好,超过IPTG诱导效果.纯化后酶活为7.5 U/mL,比活力为10.9 U/mg.     

重组鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白在毕赤酵母中表达条件的优化

为探索ChMIL18-HN在毕赤酵母中最适宜的表达条件,采用小型摇瓶培养系统,通过对重组毕赤酵母菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在不同诱导时间、培养液pH值、甲醇诱导剂剂量及培养温度的条件下表达目的蛋白的分析,以对其表达条件进行优化。结果表明:重组菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在pH6.5,甲醇诱导浓度为1.5%,培养诱导温度为30℃的条件下诱导156h,目的蛋白的表达量最高。     

重组毕赤酵母体系生成PlUGT1蛋白适宜条件研究

通过单因素试验分别研究pH值和温度对重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1生长以及甲醇浓度、pH值和温度对诱导表达PlUGT1蛋白的影响.结果表明,pH6.5和30 ℃是培养重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1最佳的生长条件,重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1诱导表达蛋白的适宜条件为甲醇体积分数0.5%、30 ℃和pH5.0,该条件下培养72 h,培养液中的蛋白质量浓度为0.721mg/mL.